РОЛЬ ГЕНОВ RAD50 И SMARCA5 В РЕГУЛЯЦИИ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИК ЦИСПЛАТИНУ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК РАКА ЯИЧНИКАИ РАКА ГОЛОВЫ И ШЕИ

Полный текст

Несмотря на прогрессивное развитие таргетных противоопухолевых препаратов, воздействующих на специфические для опухолевых клеток молекулярные мишени, применение классических химиопрепаратов с высоким цитотоксическим действием продолжает занимать значительное место в монотерапии и комбинированной терапии рака. Цисплатин, несмотря на выраженное побочное действие, остается стандартом терапии для ряда опухолей, таких как рак яичника, яичка, молочной железы (РМЖ), легкого, головы и шеи, желудка, толстой кишки, почки, мочевого пузыря и других видов рака. Цисплатин вызывает нарушения молекулярной структуры ДНК, которые заключаются в формировании моноаддуктов и поперечных сшивок, индуцирующих образование двухцепочечных разрывов ДНК и активацию сигнальных путей апоптоза в опухолевых клетках [1, 2]. Следует отметить, что эффект цисплатина варьирует у разных больных, что предположительно связано с различным ответом на применяемую терапию вследствие индивидуального разнообразия молекулярных нарушений в опухолях пациентов. Прогноз течения заболевания нередко определяется степенью чувствительности опухоли к терапии цисплатином. Устойчивые к действию цисплатина опухоли имеют крайне неблагоприятный прогноз. Молекулярные механизмы устойчивости к цисплатину не до конца изучены, однако известно, что в них участвуют сигнальные пути, активирующиеся в ответ на повреждение ДНК (DDR - DNA Damage Response) [3-5]. Понимание молекулярных механизмов, лежащих в основе действия цисплатина, а также поиск новых маркеров, вовлеченных в регуляцию ответа на терапию цисплатином, могут не только значительно улучшить эффект этого препарата, но также позволят предсказывать, будет ли лечение эффективным у того или иного больного. Для поиска потенциальных опухолевых маркеров нами был использован метод SEREX (Serological Identification of cDNA Expression Libraries), который выявил два аутоантигена медуллярной карциномы молочной железы, а именно RAD50 и SMARCA5, которые могут быть вовлечены в регуляцию чувствительности злокачественных опухолей к терапии ДНК повреждающими агентами и являются потенциальными предиктивными маркерами терапии цисплатином [6-8]. RAD50 входит в состав комплекса MRN (Mre11/RAD50/Nbs1), осуществляющего репарацию двухцепочечных разрывов ДНК и поддержание целостности теломер [9, 10]. Было показано, что подавление экспрессии RAD50 влияет на чувствительность клеток рака молочной железы к повреждающему действию цисплатина [11, 12]. Белок SMARCA5/SNF2H входит в состав различных ремоделирующих хроматин комплексов, а также вовлечен в ответ на повреждения ДНК. Было показано, что подавление экспрессии SMARCA5 увеличивает чувствительность опухолевых клеток к действию ионизирующей радиации, которое заключается в формировании двухцепочечных разрывов ДНК [13]. Эти данные могут свидетельствовать о потенциальной вовлеченности SMARCA5 в регуляцию ответа на терапию цисплатином, который имеет сходный механизм с действием ионизирующей радиации. Молекулярные механизмы, ответственные за привлечение RAD50 и SMARCA5 к месту повреждения ДНК, схематично представлены на рис. 1. Целью данной работы являлась оценка влияния генов RAD50 и SMARCA5 на чувствительность к цисплатину и их роли в регуляции ответа на повреждение ДНК в клеточных линиях рака яичника (OVCAR8) и головы и шеи (SCC61, SCC25). Для оценки специфичности данного влияния мы также изучали действие нокдауна данных генов на чувствительность к ряду других химиопрепаратов, таких как 5-фторурацил (5-ФУ) и олапариб, имеющих отличный от цисплатина молекулярный механизм повреждения ДНК. 5-ФУ приводит к угнетению репликации ДНК путем истощения запаса тимина в клетке, а олапариб вызывает повреждение ДНК путем ингибирования поли-(АДФ-рибоза)-полимеразы (PARP1), участвующей в репарации ДНК. Материал и методы Культура клеток В экспериментах in vitro были использованы клеточные линии плоскоклеточной карциномы головы и шеи SCC61 и SCC25 (American Type Culture Collection (ATCC), США), а также клеточная линия карциномы яичника OVCAR8, резистентная к действию цисплатина. Клетки SCC61 и SCC25 культивировали в бреде DMEM-F12, содержащей 10% сыворотки теленка и 1% L-глютамин, пенициллин и стрептомицин («Sigma», США). Клетки OVCAR8 культивировали в среде RPMI-1640, также содержащей 10% сыворотки теленка и 1% L-глютамин, пенициллин и стрептомицин. Трансфекция клеток при помощи миРНК, обработка клеток лекарственными препаратами, анализ выживаемости клеток Все миРНК были приобретены в фирме «Qiagen» (Германия). Трансфекцию клеток проводили в 96-луночном планшете при помощи 10 нМ миРНК и трансфекционного реагента DF1 («Dharmacon», США) согласно протоколу производителя. Количество клеток, вносимых в каждую лунку 96-луночного планшета, различалось между клеточными линиями: 10 000 клеток на лунку для SCC61 и SCC25, 4000 клеток на лунку для OVCAR8 в финальном объеме питательной среды 90 мкл на лунку. Через 24 ч после трансфекции к клеткам добавляли лекарственные вещества, применяемые в лечении опухолей головы и шеи, а также рака яичника: цисплатин, (5-ФУ) и олапариб (Fox Chase Cancer Center, Cell Culture Facility, США). Через 72 ч после добавления лекарств проводили анализ выживаемости клеток. К клеткам добавляли 10 мкл на лунку реагента Cell Titer Blue («Promega», США). Через 3 ч после добавления реагента флюоресценцию клеток считывали при помощи спектрофотометра на длине волны 573 нм. Интенсивность сигнала была прямо пропорциональна количеству жизнеспособных клеток в лунке. Ген REV3L, известный как регулятор чувствительности к цисплатину согласно данным литературы и связанный с DDR, был взят в качестве положительного контроля сенситизации к цисплатину [14-16]. В качестве отрицательного контроля использовали РНК против гена GL2, кодирующего люциферазу светлячка, не имеющую мишени в клетках человека. Результаты анализа были нормализованы на контроль GL2. Анализ фосфорилирования гистонового белка H2AX методом иммунофлуоресцентной микроскопии Количественная оценка фокусов репарации ДНК, возникающих в результате фосфорилирования гистонового белка H2AX (γ-H2AX - обозначение для фосфорилированной формы белка), который является маркером двухцепочечных разрывов ДНК, выполнена при помощи автоматизированного высокопроизводительного флуоресцентного микроскопа ImageXpress Micro с использованием программного обеспечения MetaXpress и AcuityXpress («Molecular Devices», Саннивейл, США). Предварительно была проведена трансфекция клеток OVCAR8, SCC61 и SCC25 в 96-луночном планшете. миРНК против гена CHEK1 использовали в качестве положительного контроля, поскольку, согласно данным литературы, нокдаун этого гена сам по себе повышает базовый уровень фокусов репарации ДНК, образованных γ-H2AX [17, 18]. миРНК против гена GL2 использовали в качестве отрицательного контроля. Через 24 ч после трансфекции к клеткам было добавлено 16 и 30 uM цисплатина или питательная среда в том же объеме в качестве контроля. Через 18 ч клетки отмыли холодным натрий-фосфатным буфером и зафиксировали 4% параформальдегидом, в течение 10 мин клетки были вновь отмыты и пермеабилизованы 0,1% раствором Triton-X100 («Sigma-Aldrich» США). Окрашивание клеток проводили с использованием первичных антител к γ-H2AX (1:1000, Mouse Monoclonal, Millipore Upstate, Биллерика, США) в течение 12 ч при 4 °C и вторичных антител, меченных FITC (1:1000, goat anti-mouse IgG (H+L), «AlexaFluor»® 488 conjugate), в течение 1 ч при комнатной температуре. Результаты Влияние нокдауна генов RAD50 и SMARCA5 на выживаемость и чувствительность к цисплатину и другим химиопрепаратам в клеточных линиях рака яичника OVCAR8 и плоскоклеточной карциномы головы и шеи SCC61 и SCC25 Нами были установлены влияние, которое оказывает нокдаун RAD50 и SMARCA5 на жизнеспособность опухолевых клеток человека, и роль данных генов в регуляции чувствительности опухолевых клеток к цисплатину, а также другим распространенным в терапии рака яичника и опухолей головы и шеи химиопрепаратам, таким как 5-ФУ и олапариб. Для нокдауна каждого гена использовали смесь двух лучших миРНК, заявленных фирмой-производителем («Qiagen», Германия). Через 24 ч после трансфекции к клеткам добавляли цисплатин в концентрации IC20-IC30 (рис. 2) и питательную среду в таком же объеме, что и цисплатин, в качестве отрицательного контроля. Нокдаун генов RAD50 и SMARCA5 значительно снижал жизнеспособность (на 30-60%) опухолевых клеток (рис. 3). При этом наиболее выраженный цитотоксический эффект нокдауна данных генов был показан в клеточной линии рака яичника OVCAR-8, резистентной к действию цисплатина (см. рис. 3, в). Таким образом, можно предположить, что экспрессия этих генов играет существенную роль в жизнедеятельности опухолевых клеток. Мы оценивали влияние нокдауна генов RAD50 и SMARCA5 на чувствительность клеток непосредственно к цисплатину. После 72 ч обработки препаратом мы обнаружили повышение чувствительности к токсическому действию цисплатина в клеточных линиях опухоли головы и шеи с нокдауном генов RAD50 и SMARCA5 (для нокдауна данного гена эффект сенситизации наблюдался по крайней мере в одной из клеточных линий) (см. рис. 2, а, б). Эти результаты коррелируют с данными, полученными на клеточных линиях рака молочной железы для гена RAD50 [11]. В клеточной линии OVCAR-8, полученной от пациентки с приобретенной устойчивостью к терапии цисплатином, также наблюдался выраженный эффект сенситизации к цисплатину в случае нокдауна генов RAD50 и SMARCA5 (см. рис. 2, в). Эти данные могут свидетельствовать о том, что гены RAD50 и SMARCA5 могут быть вовлечены в механизм резистентности клеточной линии OVCAR8 к действию цисплатина. Мы также определяли, насколько специфичен к действию цисплатина оказываемый эффект сенситизации, повторив эксперимент с участием других препаратов, повреждающих ДНК. Паттерны сенситизации к 5-ФУ и олапарибу были сходны с паттерном чувствительности к цисплатину (см. рис. 2). Можно предположить, что данный эффект связан со сходными молекулярными механизмами, определяющими чувствительность опухолевых клеток к данным ДНК-повреждающим препаратам. Так, распознавание повреждений ДНК и активация систем ответа на повреждение - базовый неспеци-фический процесс, не зависящий от рода повреждающего агента (ионизирующая радиация или химиотерапевтический препарат). Повреждение ДНК связано с фосфорилированием главных киназ ATR и ATM, отвечающим за активацию множества сигнальных путей, ответственных за различные виды репарации и регуляцию клеточного цикла в клетке. Под действием киназ ATR/ATM с последующей активацией киназ CHEK1 и CHEK2 [19] в области повреждения ДНК фосфорилируется гистоновый белок H2AX, что является первым этапом в запуске сигнального каскада, вызывающего привлечение в место повреждения белков и сборку комплексов репарации. Нарушение ответа на повреждение ДНК на самых ранних этапах может лежать в основе сенситизации опухолевых клеток с нокдауном генов RAD50 и SMARCA5 к действию ДНК повреждающих препаратов. Влияние нокдауна генов RAD50 и SMARCA5 на фосфорилирование гистонового белка H2AX, известного маркера повреждения ДНК в клеточной линии рака яичника OVCAR-8 и плоскоклеточной карциномы головы и шеи SCC61 и SCC25 Для проверки данной гипотезы о возможном молекулярном механизме, лежащем в основе сенситизации опухолевых клеток с нокдауном генов RAD50 и SMARCA5 к ДНК-повреждающим препаратам, мы исследовали влияние нокдауна данных генов на формирование фокусов репарации - H2AX. Хорошо известно, что повреждение ДНК, в том числе вызванное действием цисплатина, характеризуется формированием фокусов репарации, которые возникают в результате фосфорилирования гистонового белка H2AX (γ-H2AX) [20, 21]. Было показано, что нокдаун гена SMARCA5 не оказывал влияния на уровень γ-H2AX в присутствии цисплатина, однако приводил к увеличению базового уровня фокусов γ-H2AX в контрольных образцах без добавления цисплатина. В то же время нокдаун гена RAD50 не менял ни базовый γ-H2AX, ни уровень фосфорилирования гистонового белка в присутствии цисплатина (рис. 4). Данные результаты указывают на роль SMARCA5 в регуляции уровня фосфорилирования гистонового белка H2AX. Отсутствие влияния нокдауна генов на уровень фосфорилирования H2AX в условиях повреждения ДНК позволяет предположить, что влияние данных генов на чувствительность к цисплатину связано с более поздними этапами активации ответа клетки на повреждение. Таким образом, идентификация молекулярных механизмов регуляции данными генами чувствительности к цисплатину требует дальнейших исследований. Обсуждение RAD50 и SMARCA5 играют важную роль в процессах репарации ДНК и являются известными маркерами резистентности к цисплатину при раке молочной железы [9-12, 22, 23]. В данной работе нами была показана роль генов RAD50 и SMARCA5 в регуляции жизнеспособности клеток опухолей головы и шеи и рака яичника. Кроме того, мы продемонстрировали роль данных генов в регуляции чувствительности опухолевых клеток к цисплатину и другим химиотерапевтическим ДНК-повреждающим препаратам, применяемым в лечении опухолей головы и шеи и рака яичника. Нокдаун генов RAD50 и SMARCA5 значительно увеличивал чувствительность клеток данных опухолей к цисплатину, 5-ФУ и олапарибу. Нами установлена роль гена SMARCA5 в регуляции базового уровня фосфорилирования H2AX. Однако нокдаун обоих генов не влиял на уровень γ-H2AX в присутствии цисплатина. Очевидно, молекулярные механизмы сенситизации к ДНК-повреждающим препаратам в данном случае реализуются на более поздних этапах ответа на повреждение. Следует отметить, что повреждающее действие цисплатина, 5-ФУ и олапариба связано также с активацией эксцизионной репарации (nucleotide excision repair (NER)) и репарацией путем гомологичной рекомбинации (homologous recombination (HR)), а также блокадой клеточного цикла на этапе репликации ДНК (блокада G1-S и S-фазы клеточного цикла) [24-27]. Оценка роли этих процессов в сенситизации к ДНК-повреждающим препаратам, опосредованной нокдауном RAD50 и SMARCA5, требует дальнейших исследований. Таким образом, гены RAD50 и SMARCA5 являются потенциальными терапевтическими мишенями в лечении и предиктивными маркерами ответа на терапию цисплатином и другими ДНК-повреждающими препаратами у пациентов с плоскоклеточной карциномой головы и шеи и раком яичника. Мы надеемся, что полученные нами данные помогут лучше понять механизмы возникновения резистентности и разработать возможные пути ее преодоления в клинике.

Об авторах

Анна Владиславовна Гапонова

ФГАОУ ВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет»

Email: annagaponova28@gmail.com
младший научный сотрудник кафедры биохимии; 420008, г. Казань, ул. Кремлевская, д. 18 420008, г. Казань, Россия

И. Г Серебрийский

ФГАОУ ВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет»

420008, г. Казань, Россия

Р. Г Киямова

ФГАОУ ВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет»

420008, г. Казань, Россия

Список литературы

Дополнительные файлы