Cytotoxicity of curcumin-loaded nanoparticles based on amphiphilic poly-N-vinylpyrrolidone derivatives in 2D and 3D in vitro models of human ovarian adenocarcinoma

全文:

Обоснование

Наноносители играют важную роль в современной медицине, открывая возможности для направленной доставки противораковых препаратов непосредственно в опухолевые клетки, что существенно снижает побочные эффекты и усиливает их терапевтический эффект. В частности, инкапсулирование липофильных противоопухолевых лекарств в наноносители позволяет повысить их эффективность в связи с улучшением их растворимости, селективности и пролонгированного высвобождения [1].

На сегодняшний день перспективны полимерные наноносители, в частности наночастицы, обладающие высокой стабильностью, низкой токсичностью и возможностью эффективно инкапсулировать липофильные препараты [2]. Некоторые мицеллярные наноносители, загруженные противоопухолевыми препаратами, уже попали на фармацевтический рынок или находятся на разных стадиях клинических испытаний [3]. На данный момент особенно активно исследуются полимерные наночастицы, основанные на амфифильных блок-сополимерах, позволяющих осуществлять различные структурные и функциональные модификации формируемой системы доставки [4, 5]. К перспективным полимерам относится биосовместимый и биоразлагаемый поли-N-винилпирролидон (ПВП), на основе которого можно получать высокостабильные полимерные наноразмерные частицы [6]. Так, наночастицы из амфифильных производных поли-N-винилпирролидона стабильны в присутствии сыворотки крови, не оказывают существенного влияния на функции клеток крови и активацию системы комплемента, не обладают гемолитическим или воспалительным действием [7]. Ранее была показана возможность загрузки таких наночастиц на основе амфифильных производных ПВП противовоспалительным препаратом индометацином [8] и противоопухолевым препаратом бортезомибом [9].

Куркумин представляет собой полифенольный пигмент из корневища Curcuma longa, способный эффективно воздействовать на различные внутриклеточные сигнальные пути, оказывая, помимо противоопухолевого, также противовоспалительное, иммуномодулирующее, нейропротекторное, гепатопротекторное и противовирусное действие [10]. Куркумин часто используют в качестве модельного лекарства при разработке новых систем доставки, поскольку он является липофильным веществом, как большинство используемых в клинике противоопухолевых лекарств, имеет противоопухолевую активность и легко детектируется по флуоресценции. Показан потенциал применения куркумина для лечения различных типов опухолей, в частности аденокарциномы яичника человека [11, 12]. Однако стоит отметить, что терапевтическое применение куркумина и его аналогов ограничено низкой химической стабильностью и биодоступностью вследствие его липофильной природы [13]. Инкапсулирование в наноносители может позволить получить стабильные и эффективные лекарственные формы куркумина и тем самым повысить его эффективность, а также расширить спектр его применения, в том числе в качестве дополнительного средства для противоопухолевой терапии.

Цель работы заключалась в получении полимерных наночастиц на основе амфифильных производных ПВП и его сополимеров с акриловой кислотой, загруженных куркумином; изучении их накопления в опухолевых клетках; оценке цитотоксичности in vitro на 2D- (монослойная культура клеток) и 3D-моделях (мультиклеточные сфероиды) на основе клеточной линии аденокарциномы яичника человека OVCAR-3.

В данной работе мы показали цитотоксическую активность наноносителей на основе амфифильных производных ПВП и его сополимеров с акриловой кислотой, загруженных куркумином, в отношении клеток аденокарциномы яичника человека в двух моделях in vitro. Кроме того, продемонстировали, что модификация поверхности наночастиц функциональными малеимидными группами не приводила к появлению цитотоксичности. Такие модифицированные наночастицы в будущем можно использовать для ковалентой сшивки с белковыми молекулами (лигандами) для таргетной доставки в раковые клетки. Полученные результаты могут послужить основой для дальнейших исследований по безопасности и противоопухолевой активности in vivo наночастиц на основе амфифильных производных ПВП, загруженных куркумином или другими липофильными препаратами с противоопухолевой активностью.

Материалы и методы

Дизайн исследования

Дизайн данной работы состоял из трёх этапов.

Первый этап — синтез полимеров на основе амфифильных производных ПВП, получение полимерных наночастиц с включённым куркумином.

Второй этап — оценка эффективности накопления наночастиц опухолевыми клетками OVCAR3 (2D- и 3D-модели in vitro).

Третий этап — оценка цитотоксической активности загруженных куркумином наночастиц в 2D- и 3D-моделях на основе опухолевых клеток OVCAR3 in vitro.

Условия проведения и продолжительность исследования

Исследование проводилось на базе Института биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук, Российского химико-технологического университета им. Д.И. Менделеева и Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова. Продолжительность исследования: 03.2024–09.2024.

Описание методологии исследования

Синтез полимеров на основе амфифильных производных ПВП

Синтезированы два типа полимеров, представляющих собой амфифильные производные ПВП с молекулярной массой 3 кДа: Амф-ПВП (ПВП с одним концевым н-октадецильным фрагментом) и Амф-ПВП-АК (сополимер N-винилпирролидона и акриловой кислоты с одним концевым н-октадецильным фрагментом). Амф-ПВП и Амф-ПВП-АК получали следующим образом: в круглодонную колбу на 250 мл добавляли навески 0,115 г 2,2›-азобисизобутиронитрила (ДАК) и 0,429 г октадецилмеркаптана, затем приливали раствор 10,7 мл N-винилпирролидона в 40 мл 1,4-диоксана. В случае полимера Амф-ПВП-АК в систему также добавляли 350 мкл акриловой кислоты. Реакционную смесь перемешивали 5 мин до полного растворения всех компонентов. Полученный раствор оставляли при комнатной температуре на 1 ч, затем добавляли 100 мл дистиллированной воды. После этого отгоняли полученную полимерную смесь на ротационном испарителе (Hei-Vap Value Digital, Heidolph Instruments, Германия) для избавления от 1,4-диоксана. Готовую смесь диализовали против воды (Slide-A-Lyzer™ Dialysis Flask, 1 K MWCO, Thermo Scientfic, США) в течение 4 дней и лиофилизовали (Alpha 1-4 LD plus, Martin Christ, Германия). Молекулярную массу полимеров определяли функциональным анализом (потенциометрическое титрование).

Модификация полимера Амф-ПВП-АК малеимидными группами

Навеску Амф-ПВП-АК 0,5 г диспергировали в 25 мл воды. Для модификации Амф-ПВП-АК подготавливали два раствора — 1 мг (1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида в 2 мл воды и 16 мг N-гидроксисункцинимида в 3 мл воды — и оставляли перемешиваться в течение 15 мин, затем оба раствора приливали к раствору наночастиц. Навеску 4 мг 1-(2-аминоэтил)малеимида растворили в 5 мл воды и добавили к раствору наночастиц, и затем всю реакционную смесь перемешивали в течение 24 ч. Модифицированные наночастицы диализовали против воды, замораживали и лиофилизовали. Готовый порошок состоял из наночастиц, которые можно диспергировать в воде или фосфатно-солевом буфере (pH 7,4) для получения стабильной суспензии наночастиц.

Получение наночастиц из амфифильных производных ПВП, нагруженных куркумином (Амф-ПВП-Кур)

Наночастицы Амф-ПВП-Кур получены эмульсионным методом. Для этого 0,1 г полимера диспергировали в 20 мл воды, а 0,0014 г куркумина растворили в 5 мл ацетона. Затем раствор полимера подвергали ультразвуковой обработке в течение 5 мин при охлаждении. По окончании гомогенизации к раствору полимера приливали раствор куркумина и также подвергали ультразвуковой обработке ещё 5 мин. Ацетон отгоняли на роторном испарителе (Hei-Vap Value Digital, Heidolph Instruments, Германия). Для отделения невключённого куркумина суспензию центрифугировали (Sigma 4–5 L, Германия). После этого супернатант лиофилизировали. Готовый порошок состоял из наночастиц, которые можно диспергировать в воде или фосфатно-солевом буфере для получения стабильной суспензии частиц.

Получение наночастиц из амфифильных производных поли-N-винилпирролидона, модифицированных акриловой кислотой и малеимидными группами и нагруженных куркумином (Амф-ПВП-АК-Мал-Кур)

Наночастицы Амф-ПВП-АК-Мал-Кур получены эмульсионным методом. Для этого 0,5 г полимера диспергировали в 25 мл воды, а 0,002 г куркумина растворили в 5 мл ацетона. Затем раствор полимера подвергали ультразвуковой обработке в течение 5 мин при охлаждении. По окончании гомогенизации к раствору полимера приливали раствор куркумина и также подвергали ультразвуковой обработке ещё 5 мин. Ацетон отгоняли на роторном испарителе (Hei-Vap Value Digital, Heidolph Instruments, Германия). Для отделения невключённого куркумина суспензию центрифугировали (Sigma 4–5 L, Германия). После этого отбирали супернатант. Для модификации полученных наночастиц подготавливали два раствора — 1 мг (1-этил-3-(3-диметиламинопропил)карбодиимида в 2 мл воды и 16 мг N-гидроксисункцинимида в 3 мл воды, и оставляли их перемешиваться в течение 15 мин, а затем оба раствора приливали к раствору наночастиц. Навеску 4 мг 1-(2-аминоэтил)малеимида растворяли в 5 мл воды и добавили к раствору наночастиц, всю реакционную смесь перемешивали в течение 24 ч. Готовые модифицированные наночастицы диализовали против воды, замораживали и лиофильно высушивали. Готовый порошок состоял из наночастиц, которые можно диспергировать в воде или фосфатно-солевом буфере для получения стабильной суспензии частиц. Размеры частиц определяли методом динамического светорассеяния (Zetasizer Nano ZS, Marvern). Средний размер наночастиц лежал в диапазоне до 350 нм.

Эффективность включения куркумина в наночастицы рассчитывали по отношению общего содержания куркумина в частицах к общему количеству загруженного куркумина. Профиль высвобождения куркумина из наноразмерных частиц исследовали на протяжении 24 ч, как описано ранее [14]. Вкратце: наночастицы суспендировали в фосфатно-солевом буфере (pH 7,4), после чего суспензию центрифугировали (9000 g, 15 мин) и определяли в буфере количество высвободившегося куркумина спектрофотометрически при 425 нм. Аликвоты проб отбирали через 0,5, 1, 2, 6, 12, 16 и 24 ч.

Культивирование клеток

Клеточная линия аденокарциномы яичника человека OVCAR-3 (Американская коллекция типовых клеточных культур, АТСС, США, Кат. № НТВ-161) была любезно предоставлена канд. биол. наук В.В. Татарским (Институт биологии гена Российской академии наук). Клетки культивировали в среде RPMI-1640 с добавлением 10% телячьей эмбриональной сыворотки (FBS) в СО₂-инкубаторе (N-BIOTEK NB-203, Южная Корея) при 37 °С в газовоздушной среде, содержащей 5% СО₂. Наблюдение за ростом клеток осуществляли ежедневно с помощью светового инвертированного микроскопа (Reichert Microstar 1820E, Германия).

Получение мультиклеточных сфероидов

Получение мультиклеточных сфероидов проводили непосредственно из монослойной культуры клеток OVCAR-3 по методике, разработанной авторами ранее [14]. Для этого в 96-луночный планшет (SPL Lifesciences, Корея) вносили суспензию клеток из расчёта 7500 клеток на лунку (в 100 мкл питательной среды RPMI-1640, 10% FBS), после чего планшет помещали в СО₂-инкубатор на 24 ч. Затем заменяли среду на 100 мкл свежей (с 10% FBS), содержащей 40 мкМ синтетического циклического RGD-пептида (cyclo-RGDfK(TPP). Планшет переносили в СО₂-инкубатор, где в течение 72 ч происходила самопроизвольная агрегация клеток с образованием мультиклеточных сфероидов. Размеры сфероидов определяли с помощью светового микроскопа. Средний размер сфероидов был 150 нм.

Исследование эффективности накопления полимерных наночастиц in vitro

Проточная цитометрия

Для количественной оценки эффективности накопления полимерных наночастиц в клетках монослойной культуры OVCAR-3 использован метод проточной цитометрии на флуоресцентно-активируемом проточном цитометре (BD FACSCalibur, США) с программным обеспечением BD CellQuest. Клетки высеивали в 24-луночный планшет (50 000 клеток на лунку) с последующей инкубацией в течение 24 ч (37 °С, 5% СО₂). Затем старую культуральную среду удаляли и добавляли свежую среду RPMI-1640, содержащую суспензию полимерных наночастиц, загруженных куркумином (0,5 мг/мл, образцы Амф-ПВП-Кур и Амф-ПВП-АК-Мал-Кур соответственно). Далее клетки инкубировали с образцами в течение 5, 30 и 60 мин, после чего несвязавшиеся наночастицы удаляли трёхкратной промывкой фосфатно-солевым буфером (рН 7,4). Изучение образцов проводили при длине волны 488 нм. Данные проточной цитометрии выражали как среднюю интенсивность флуоресценции, делённую на фоновую интенсивность контрольной группы (необработанные клетки).

Флуориметрия

Количественную оценку накопления полимерных наночастиц в клетках сфероидов проводили с помощью флуориметрического анализа. Для этого культуральную среду заменяли на свежую, содержащую 0,5 мг/мл суспензии полимерных наночастиц Амф-ПВП-Кур и Амф-ПВП-АК-Мал-Кур, и инкубировали (37 °С, 5% СО₂) со сфероидами в течение 1, 3 и 7 ч соответственно. Затем сфероиды трижды отмывали от несвязавшихся наночастиц PBS (рН 7,4) и измеряли средний уровень флуоресценции (Promega GloMax-Multi detection system, США) при длине волны 425 нм (Кур λex=571 нм, λem=467 нм). Данные о поглощении выражали в процентах от флуоресценции наночастиц, поглощённых клетками, по сравнению с флуоресценцией исходного раствора.

Исследование цитотоксичности полимерных наночастиц in vitro

Цитотоксичность наночастиц оценивали с помощью МТТ-теста. Для этого в случае монослойной культуры (2D-модель in vitro) клетки рассеивали в 96-луночный культуральный планшет (7500 клеток на лунку) и оставляли в инкубаторе (5% СО2, 37 °С) на 24 ч. В случае сфероидов (3D-модель in vitro) использовали планшет с заранее подготовленными сфероидами. Затем среду удаляли, а к клеткам или сфероидам добавляли свежую питательную среду RPMI-1640 (10% FBS), содержащую образцы наночастиц в различных концентрациях (1, 10, 50, 100 и 500 мкг/мл) и инкубировали в течение 24 и 48 ч. После инкубации клетки или сфероиды обрабатывали 0,05% раствором МТТ-реагента в RPMI-1640 (без FBS) и оставляли на 3 ч. Далее среду удаляли, заменяли на диметилсульфоксид (100 мкл на лунку) и измеряли адсорбцию с помощью Multiskan FC reader (Thermo Scientific, США) при длине волны 540 нм. Полуингибирующая концентрация (IC50) была определена как концентрация образца, приводящая к подавлению роста 50% клеток. Монослойная культура клеток и сфероиды, к которым не добавляли наночастицы, были использованы в качестве контроля (100% жизнеспособных клеток). Результаты МТТ-теста были обработаны с помощью программы GraphPad Prism (США).

Статистический анализ

Все данные были распределены нормально и выражены в виде среднего значения или среднее ± стандартное отклонение. Статистический анализ результатов проточной цитофлуориметрии и флуориметрии проводился с использованием двустороннего дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим тестом множественных сравнений Сидака. Анализ результатов МТТ-теста проводили с помощью двустороннего дисперсионного анализа (ANOVA) с последующим тестом множественных сравнений Тьюки. Все эксперименты проводились не менее чем с 3 повторениями. Собранные данные были обработаны с использованием программного обеспечения GraphPad Prism (GraphPad Software Inc, США) и признаны достоверно отличающимися при р <0,05.

Результаты

Получение амфифильных полимеров и наноразмерных частиц на их основе

Мы получили несколько вариантов полимеров амфифильного строения на основе N-винилпирролидона с различной по составу гидрофильной частью. В первом варианте (Амф-ПВП) водорастворимый блок представлен полимером N-винилпирролидоном, а во втором варианте (Амф-ПВП-АК) — сополимером N-винилпирролидона с акриловой кислотой. Акриловая кислота позволяет вводить от 1 до 5% функциональных карбоксильных групп, что может быть использовано для дальнейшей модификации поверхности получаемых на основе таких полимеров наноразмерных носителей [15]. В данной работе карбоксильная группа акриловой кислоты использована для введения в структуру полимера малеимидных функциональных групп для дальнейшей конъюгации таргетного противоопухолевого агента в мягких условиях. Для этого гидрофильную часть, состоящую из сополимеров N-винилпирролидона и акриловой кислоты, модифицировали 1-(2-аминоэтил)малеимидом в присутствии EDS/NHS в качестве интермедиата и проводили реакцию амидирования с получением полимера Амф-ПВП-АК-Мал (рис. 1).

 

Рис. 1. Синтез амфифильных производных поли-N-винилпирролидона для последующего получения модифицированных полимерных наночастиц с куркумином.

Fig. 1. Synthesis of amphiphilic derivatives of poly-N-vinylpyrrolidone for subsequent production of modified polymeric nanoparticles with curcumin.

 

Гидрофобный участок в обоих вариантах полимеров представлен н-октадецильным фрагментом. Полимеры Амф-ПВП, Амф-ПВП-АК и Амф-ПВП-АК-Мал были получены радикальной полимеризацией в присутствии инициатора и регулятора роста цепи, что позволило контролировать молекулярную массу получаемых полимеров, которая в данной работе для обоих вариантов полимеров составила 3 кДа. Строение и состав полимеров был определён и подтверждён рядом физико-химических методов анализа (ИК- и ЯМР-спектроскопия, функциональный анализ, элементный анализ, паровая осмометрия), что отражено в наших предыдущих работах [15, 16].

Наличие как гидрофильного, так и гидрофобного фрагментов в структуре синтезированных полимеров способствует их самосборке в водных средах при концентрациях выше определённой критической концентрации агрегации с образованием наноразмерных ассоциатов по типу «гидрофобное ядро — гидрофильная оболочка». В ядро таких частиц был загружен куркумин, как плохорастворимая в воде активная субстанция, посредством гидрофобных взаимодействий с н-алкильными фрагментами полимеров, методом получения эмульсий с последующей отгонкой растворителя. В результате получили 2 типа наноразмерных агрегатов (Амф-ПВП-Кур и Амф-ПВП-АК-Мал-Кур). Характеристики полученных частиц представлены в табл. 1.

 

Таблица 1. Характеристики полимерных наноразмерных частиц

Table 1. Characteristics of polymer nanoparticles

Тип частиц	Средний размер, нм	Индекс полидисперсности	ζ-потенциал, мВ
Амф-ПВП-Кур	204	0,269	-18±-2
Амф-ПВП-АК-Мал-Кур	352	0,358	-15±-1,5

Примечание. Амф-ПВП-Кур — наночастицы из амфифильных производных поли-N-винилпирролидона, загруженные куркумином; Амф-ПВП-АК-Мал-Кур — наночастицы из амфифильных производных сополимеров поли-N-винилпирролидона с акриловой кислотой, модифицированные малеимидом и загруженные куркумином.

Note. Амф-ПВП-Кур — nanoparticles from amphiphilic derivatives of poly-N-vinylpyrrolidone loaded with curcumin; Амф-ПВП-АК-Мал-Кур — nanoparticles from amphiphilic derivatives of poly-N-vinylpyrrolidone copolymers with acrylic acid modified with maleimide and loaded with curcumin.

 

Эффективность инкапсулирования куркумина в образцах составила 93–95%. Профиль высвобождения куркумина из наночастиц исследован на протяжении 24 ч с временными промежутками 0,5, 1, 2, 6, 12, 16 и 24 ч (рис. 2).

 

Рис. 2. Профили высвобождения куркумина из наночастиц Амф-ПВП-Кур и Амф-ПВП-АК-Мал-Кур в модели in vitro. Контроль — свободный куркумин (Кур).

Fig. 2. In vitro release profiles of curcumin from the Amph-PVP-Cur and Amph-PVP-AK-Mal-Cur nanoparticles. Free curcumin was used as a control.

 

Для наночастиц Амф-ПВП-Кур и Амф-ПВП-АК-Мал-Кур наблюдался двухфазный профиль высвобождения куркумина. В течение первых 30 мин высвобождалось 11 и14% куркумина из наночастиц Амф-ПВП-Кур и Амф-ПВП-АК-Мал-Кур соответственно, после чего следовало пролонгированное высвобождение в течение 24 ч. Полное высвобождение куркумина (100%) происходило за 24 ч. Для сравнения, более 30% куркумина из контрольного образца высвободилось в течение 30 мин, а полное высвобождение было достигнуто через 3 ч.

Исследование накопления полимерных наночастиц в опухолевых клетках in vitro

Эффективность накопления полимерных наноразмерных частиц, загруженных куркумином, а именно образцов Амф-ПВП-Кур и Амф-ПВП-АК-Мал-Кур, исследована с помощью проточной цитометрии и флуориметрии (рис. 3).

 

Рис. 3. Эффективность накопления полимерных наночастиц, загруженных куркумином, в клетках монослойной культуры (2D-модель in vitro) и сфероидах (3D-модель in vitro) из клеток линии OVCAR-3 (аденокарцинома яичника человека). Проточная цитометрия (2D-модель in vitro) и флуориметрия (3D-модель in vitro). **** р <0,001.

Fig. 3. Accumulation efficiency of the polymeric nanoparticles loaded with curcumin in monolayer culture (2D in vitro model) and tumor spheroids (3D in vitro model) from human ovarian adenocarcinoma OVCAR-3 cells Flow cytometry (2D in vitro model) and fluorimetry (3D in vitro model). **** p <0.001.

 

Показано, что в случае монослойной культуры клеток OVCAR-3 (2D-модель in vitro) поглощение обоих образцов наночастиц происходило уже после 5 мин инкубации и составляло 7 и 10% для образцов Амф-ПВП-Кур и Амф-ПВП-АК-Мал-Кур соответственно. При более длительной инкубации уровни накопления обоих образцов существенно возрастали и составляли уже 36 и 29% после 30 мин, а после 60 мин инкубации — 75 и 78% соответственно.

При этом в случае сфероидов (3D-модель in vitro) существенной разницы в накоплении образцов не наблюдали, но эффективность накопления существенно снижалась. Так, после 1 ч инкубации уровни накопления Амф-ПВП-Кур и Амф-ПВП-АК-Мал-Кур составляли 29 и 34%, после 3 ч — 33 и 32%, а после 7 ч — 59 и 70% соответственно.

Исследование цитотоксической активности полимерных наночастиц, загруженных куркумином

Цитотоксичность полимерных наночастиц Амф-ПВП-Кур и Амф-ПВП-АК-Мал-Кур, загруженных куркумином, исследована на клеточной линии аденокарциномы яичника OVCAR-3 с использованием 2D- и 3D-моделей in vitro с помощью МТТ-теста (табл. 2, рис. 4). Пустые полимерные наночастицы (без куркумина), а именно образцы Амф-ПВП, Амф-ПВП-АК и Амф-ПВП-АК-Мал, использованы в качестве контролей.

 

Таблица 2. Цитотоксичность полимерных наночастиц в монослойной культуре (2D-модель in vitro) и опухолевых сфероидах (3D-модель in vitro) из клеток аденокарциномы яичника человека OVCAR-3. МТТ-тест

Table 2. Cytotoxicity of polymeric nanoparticles in monolayer culture (2D in vitro model) and tumor spheroids (3D in vitro model) from human ovarian adenocarcinoma OVCAR-3 cells. MTT test

Образец	IC50*, мкг/мл
	2D-модель in vitro		3D-модель in vitro
	24 ч	48 ч	24 ч	48 ч
Амф-ПВП-Кур	> 500	211±13	> 500
Амф-ПВП-АК-Мал-Кур		137±9

Примечание. *IC50 — полуингибирующая концентрация. Амф-ПВП — наночастицы из амфифильных производных поли-N-винилпирролидона; Амф-ПВП-АК — наночастицы из сополимеров амфифильных производных поли-N-винилпирролидона с акриловой кислотой; Амф-ПВП-АК-Мал — указанные наночастицы, модифицированные малеимидом; Амф-ПВП-Кур — наночастицы Амф-ПВП, загруженные куркумином; Амф-ПВП-АК-Мал-Кур — наночастицы Амф-ПВП-АК-Мал, загруженные куркумином.

Note. * IC50 is a semi-inhibitory concentration. Амф-ПВП — nanoparticles from amphiphilic derivatives of poly-N-vinylpyrrolidone; Амф-ПВП-АК — nanoparticles from copolymers of amphiphilic derivatives of poly-N-vinylpyrrolidone with acrylic acid; Амф-ПВП-АК-Мал — specified nanoparticles modified with maleimide; Амф-ПВП-Кур — nanoparticles from amphiphilic derivatives of poly-N-vinylpyrrolidone loaded with curcumin; Амф-ПВП-АК-Мал-Кур — nanoparticles from amphiphilic derivatives of poly-N-vinylpyrrolidone copolymers with acrylic acid modified with maleimide and loaded with curcumin.

 

Рис. 4. Цитотоксичность полимерных наночастиц в монослойной культуре (2D-модель in vitro) и в опухолевых сфероидах (3D-модель in vitro) из клеток аденокарциномы яичника человека OVCAR-3 после инкубации в течение 24 и 48 ч. МТТ-тест.

Fig. 4. Cytotoxicity of the polymeric nanoparticles in monolayer culture (2D in vitro model) and in tumor spheroids (3D in vitro model) from human ovarian adenocarcinoma OVCAR-3 cells after incubation for 24 and 48 h. MTT-test.

 

В случае монослойной культуры клеток контрольные образцы (без куркумина) оставались нетоксичными даже при его максимальной концентрации после 48 ч инкубации (IC50>500 мкг/мл). При этом образцы, загруженные куркумином, начинали оказывать цитотоксическое воздействие после 48 ч инкубации: IC50 составили 211±13 мкг/мл и 137±9 мкг/мл для образцов Амф-ПВП-Кур и Амф-ПВП-АК-Мал-Кур соответственно. При этом в опухолевых сфероидах наблюдали аналогичную тенденцию: цитотоксичность образцов Амф-ПВП-Кур и Амф-ПВП-АК-Мал-Кур возрастала после 48 ч (о чём свидетельствует характер соответствующих кривых), но не достигла полуингибирующей концентрации (IC50>500 мкг/мл).

Обсуждение

Резюме основного результата исследования

В результате исследования получены новые данные о действии наночастиц на основе амфифильных производных ПВП и его сополимеров с акриловой кислотой на опухолевые клетки линии OVCAR-3. Показано, что ни исходные полимерные наночастицы (Амф-ПВП), ни наночастицы на основе сополимера ПВП с акриловой кислотой (Амф-ПВП-АК), ни эти же наночастицы, но модифицированные малеимидом (Амф-ПВП-АК-Мал) не проявляли цитотоксичности. Однако после загрузки куркумином наночастицы Амф-ПВП-Кур и Амф-ПВП-АК-Мал-Кур демонстрировали ярко выраженный цитотоксический эффект (действие в 2D-модели) и проявляли более слабое, но вполне очевидное цитотоксическое действие на сфероидах (3D-модель), полученных из клеток аденокарциномы яичника человека OVCAR-3.

Обсуждение основного результата

Мы разработали новые наночастицы на основе амфифильных полимеров и сополимеров N-винилпирролидона с акриловой кислотой (Амф-ПВП, Амф-ПВП-АК), которые были загружены липофильным противоопухолевым препаратом куркумином. Полученные наночастицы-носители охарактеризованы с точки зрения их физико-химических свойств (средний размер, ζ-потенциал), а также эффективности их накопления в опухолевых клетках OVCAR-3. Кроме того, была изучена их цитотоксичность в 2D- (монослойная культура) и 3D-моделях (опухолевые сфероиды) in vitro аденокарциномы яичника человека OVCAR-3.

Как известно, в последнее время мультиклеточные опухолевые сфероиды рассматриваются в качестве более релевантной модели in vitro, чем монослойная культура клеток. Благодаря своей трёхмерной структуре опухолевые сфероиды могут имитировать гетерогенность и микроокружение малых солидных (от англ. solid) опухолей in vivo, включая специфическую экспрессию генов, межклеточные взаимодействия, а также контакты клеток с внеклеточным матриксом, кинетику роста, скорость метаболизма и устойчивость к химиотерапии [17].

В нашей работе мы показали, что интернализация (поглощение) клетками наночастиц с модифицированной и немодифицированной дополнительными малеимидными группами поверхностью, содержащих в своём гидрофобном ядре куркумин (образцы Амф-ПВП-Кур и Амф-ПВП-АК-Мал-Кур), происходила с приблизительно одинаковой эффективностью. Таким образом, использование наночастиц из производных сополимера ПВП с акриловой киислотой, модифицированных малеимидными группами, не оказывало существенного влияния на проникновение наноносителей в клетки. При этом в случае опухолевых сфероидов накопление происходило значительно медленнее, чем в монослойной культуре, что можно объяснить более сложным и длительным проникновением наноносителей внутрь объёмной многослойной конструкции сфероида. Полученные нами результаты подчёркивают необходимость исследования наноносителей с использованием не только всеми применяемых сегодня 2D-монослойных культур, но и 3D-моделей in vitro, позволяющих более точно имитировать условия солидной опухоли in vivo по сравнению с классическими 2D-моделями. Отметим также, что тестирование на 3D-моделях in vitro имеет ещё и важную гуманитарную составляющую, поскольку позволяет сократить количество животных в последующих доклинических испытаниях.

При изучении цитотоксичности образцов методом МТТ-теста было обнаружено, что наночастицы на основе Амф-ПВП, загруженные куркумином, подавляли метаболическую активность клеток монослойной культуры аденокарциномы яичника человека после 48 ч инкубации. Стоит отметить, что в случае сфероидов образцы Амф-ПВП-Кур и Амф-ПВП-АК-Мал-Кур также продемонстрировали умеренный цитотоксический эффект после 48 ч инкубации, но не достигли полуингибирующей концентрации. Этот результат можно объяснить более длительным временем, необходимым как для накопления наночастиц в клетках мультиклеточных сфероидов, так и для последующего высвобождения куркумина из наночастиц в сфероидах. Таким образом, как мы и ожидали, клетки в сфероидах были более резистентны к действию противоопухолевого препарата, чем в монослойной культуре. Этот результат хорошо коррелирует с ранее опубликованными результатами с другими клетками и другими противоопухолевыми препаратами [9], а также другими наноносителями, в частности полимерными наноконтейнерами, загруженными тимохиноном [18] или полиэлектролитными капсулами с доксорубицином [19].

При этом пустые полимерные наночастицы (без куркумина), использованные в качестве контроля, не проявляли цитотоксичности как в 2D-, так и в 3D-модели in vitro даже после 48 ч инкубации при всех исследованных концентрациях, что свидетельствует об отсутствии у них токсичности.

Ограничения исследования

К ограничениям исследования следует отнести недостаточный временной диапазон, в котором изучали действие наночастиц на опухолевые клетки. Однако из полученных результатов очевидно, что при увеличении времени инкубации до 72 ч и более цитотоксическое действие наночастиц, загруженных куркумином, было бы более выраженным.

Заключение

В работе получены наноносители на основе амфифильных производных полимеров N-винилпирролидона и его сополимера с акриловой кислотой, в том числе наночастицы c поверхностью, модифицированной функциональными малеимидными группами. Такая модификация наночастиц необходима для их дальнейшей конъюгации с таргетными опухоле-специфичными молекулами в рамках разработки комбинированных таргетных наносистем с противоопухолевыми свойствами. Ни одна из модификаций полученных нами наночастиц не проявила цитотоксичности по отношению к клеткам аденокарциномы яичника человека. Это позволяет констатировать, что пустые наноносители, не загруженные куркумином, не токсичны, а следовательно, они могут рассматриваться в качестве основы для разработки новых эффективных систем доставки противоопухолевых препаратов, в том числе для таргетной терапии после введения в них соответствующих специфических лигандов. С использованием клеточной линии аденокарциномы яичника человека OVCAR-3 было также показано, что после загрузки куркумином наночастицы демонстрировали выраженный цитотоксический эффект на 2D in vitro модели и умеренный цитотоксический эффект на 3D in vitro модели. Таким образом, разработанные наночастицы имеют хороший потенциал, и в будущем на их основе могут быть получены новые эффективные таргетные наносистемы для доставки противоопухолевых лекарств с высокой биодоступностью.

Дополнительная информация

Источник финансирования. Работа выполнена при поддержке гранта РНФ № 23-15-00468, https://rscf.ru/project/23-15-00468/.

Конфликт интересов. Авторы декларируют отсутствие конфликтов интересов, связанных с публикацией данной статьи.

Вклад авторов. Все авторы подтверждают соответствие своего авторства международным критериям ICMJE (все авторы внесли существенный вклад в разработку концепции, проведение исследования и подготовку статьи, прочли и одобрили финальную версию перед публикацией). Вклад авторов распределён следующим образом: А.М. Гилева — разработка дизайна исследования, выполнение экспериментальной части работы, анализ полученных данных, написание текста статьи; Д.И. Куликова — выполнение экспериментальной части работы, написание текста статьи; А.В. Яголович — разработка дизайна исследования, анализ полученных данных, статистический анализ, написание текста статьи; Е.В. Куковякина, К.С. Кушнерёв — выполнение экспериментальной части работы; Е.А. Марквичева — разработка дизайна исследования, научное редактирование статьи; А.Н. Кусков — разработка дизайна исследования, анализ полученных данных, научное редактирование статьи, руководство проектом.

Additional information

Funding source. The work was supported by the Russian Science Foundation grant #23-15-00468, https://rscf.ru/project/23-15-00468/

Competing interests. The authors declare no conflicts of interest related to the publication of this article.

Authors’ contribution. All authors confirm that their authorship complies with the international ICMJE criteria (all authors made a significant contribution to the development of the concept, conducting the study and preparing the article, read and approved the final version before publication). The authors’ contribution is distributed as follows: A.M. Gileva — study design, experimental part of the work, analysis of the obtained data, writing the text of the article; D.I. Kulikova — experimental part of the work, writing the text of the article; A.V. Yagolovich — study design, analysis of the obtained data, statistical analysis, writing the text of the article; E.V. Kukovyakina, K.S. Kushnerev — experimental part of the work; E.A. Markvicheva — study design, scientific editing of the article; A.N. Kuskov — study design, analysis of the obtained data, scientific editing of the article, project management.

作者简介

Anastasia Gileva

Shemyakin–Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry RAS; Mendeleev Russian University of Chemical Technology

编辑信件的主要联系方式.
Email: sumina.anastasia@mail.ru
ORCID iD: 0000-0001-8220-0580
SPIN 代码: 3401-5241

junior researcher

俄罗斯联邦, Moscow; Moscow

Daria Kulikova

Shemyakin–Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry RAS; Mendeleev Russian University of Chemical Technology

Email: dkulikovaaa@mail.ru
俄罗斯联邦, Moscow; Moscow

Ekaterina Kukovyakina

Mendeleev Russian University of Chemical Technology

Email: kev0700@yandex.ru
ORCID iD: 0009-0008-2918-185X
SPIN 代码: 9172-4087
俄罗斯联邦, Moscow

Anne Yagolovich

Lomonosov Moscow State University

Email: anne-gor2002@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-3145-3726
SPIN 代码: 2076-1814

Cand. Sci. (Biology)

俄罗斯联邦, Moscow

Kirill Kushnerev

Mendeleev Russian University of Chemical Technology

Email: firstavenue@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-2866-9796
SPIN 代码: 4968-0941
俄罗斯联邦, Moscow

Andrey Kuskov

Mendeleev Russian University of Chemical Technology

Email: kuskov.a.n@muctr.ru
ORCID iD: 0000-0001-8140-2754
SPIN 代码: 6115-8494
Researcher ID: R-7314-2016

Dr. Sci. (Chemistry), Professor 

俄罗斯联邦, Moscow

Elena Markvicheva

Shemyakin–Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry RAS

Email: lemarkv@hotmail.com
ORCID iD: 0000-0001-6652-3267

Dr. Sci. (Chemistry)

俄罗斯联邦, Moscow

参考

补充文件