INFLUENCE OF PREGNA-D’-PENTARANES ON CELL CULTURES HELA AND MONONUCLEAR CELL FRACTION OF PERIPHERAL BLOOD

Full Text

Селективные лиганды рецепторов прогестерона (РП) используются в лечении различных онкоги-некологических заболеваний. Среди синтетических прогестинов перспективным является класс биологически активных аналогов прогестерона (16а,17а-циклоалканопрогестеронов - прегна-Б'-пентаранов) (рис. 1), созданный в лаборатории стероидов Института органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН. Данные соединения обладают минимально искаженной по сравнению с нативным гормоном геометрией стероидного скелета, что приводит к близкому, но достоверно различающемуся сродству с РП экспериментальных животных и симбатности взаимодействия их комплексов с компетентным участком связывания ДНК и эффектом in vivo [1, 2, 3]. Среди полученных пентаранов выявлены как агонисты, так и антагонисты прогестерона, обладающие высоким терапевтическим и контрацептивным эффектами [4]. Первой и необходимой стадией действия прогести-нов на клетки-мишени является их связывание с РП, что используется для скрининга новых активных соединений. Следующим шагом в исследовании потенциальных противоопухолевых соединений является анализ их влияния на жизнеспособность линий клеток. Стандартной тест-системой для этой цели являются линии опухолевых клеток репродуктивной системы женщины - MCF-7, HeLa и др. При выявлении соединений, подавляющих пролиферацию опухолевых клеток, следует также оценить их эффект на неизмененные клетки для минимизации побочных эффектов уже на стадии доклинических испытаний препаратов. Целью настоящей работы является изучение связывания новой серии пентаранов I-VI (рис. 1; см. таблицу) с РП на двух моделях - мононуклеарной фракции клеток (МНФК) периферической крови и в культуре клеток HeLa, их влияния на выживаемость клеток этих культур и на уровень продукции ФНО-альфа МНФК. Первая модель является удобной и доступной для изучения действия стероидов, появившаяся в арсенале экспериментальной фармакологии после выявления РП в МНФК [5, 6], вторая модель широко используется для первичной оценки противоопухолевой активности новых соединений [7]. Для корреспонденции: Карева Елена Николаевна - д-р мед. наук, проф. каф. молекулярной фармакологии и радиобиологии им. акад. П.В. Сергеева; 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1; e-mail: elenakareva@mail.ru. Материал и методы Стероиды I-VI синтезированы в лаборатории стероидов Института органической химии им. Н.Д. Зелинского РАН. Забор крови из локтевой вены производили в первую фазу менструального цикла у 32 пациенток с миомой матки, проходивших обследование в отделении гинекологической эндокринологии МОНИИ-АГ. Возраст всех пациенток составил 36,8 ± 0,78 года. Условиями включения в исследование являлись неиспользование гормональных препаратов в течение трех последних месяцев, отсутствие тяжелой соматической патологии и выраженных метаболических нарушений. МНФК периферической крови выделяли стандартным методом [8]. Состав фракции: в среднем -Т-лимфоциты 57,0 ± 3,5%, В-лимфоциты 14,7 ± 1,0%, моноциты 6,1 ± 0,8%, что находится в пределах рефе-ренсных значений. Клетки HeLa получены из банка клеток Всероссийского научного центра молекулярной диагностики и лечения. Относительная связывающая активность испытуемых соединений в культурах клеток изучалась методом радиолигандного анализа [2, 9]. В стерильный планшет за сутки до исследования вносили спиртовой раствор 3Н-прогестерона («Am-ersham») из расчета в конечной концентрации 50 нМ. Для определения неспецифического связывания использовали 200-кратный избыток немеченого гормона («Sigma»). Специфическое связывание исследуемых соединений с РП оценивали по проценту вытеснения меченого прогестерона из комплекса с РП в присутствии 4 мкМ тестируемого вещества и 1 мкМ дексаме-тазона в среде инкубации. В качестве контроля (100% связывание) использовали прогестерон. В каждую лунку вносили 500 000-1 000 000 клеток выделенной фракции. Время инкубации составило 60 мин. Исследование проводили при 4°С. Отделение несвязанного стероида осуществляли фильтрацией через стеклянные фильтры GF/B («Whatman») с 5-кратной промывкой 100 объемами ледяного буфера. Изучение влияния стероидов (50 нМ) на цитокинопродукцию МНФК проводили в стерильных условиях (инкубация 72 ч при 37оС, 5% СО2). Определение количества цитокинов в среде инкубации МНФК проводили с использованием ИФА-наборов («Вектор-Бест») по инструкции. Влияние пен-таранов на жизнеспособность (метаболическую активность) клеток оценивалось с помощью МТТ-теста. Оптическую плотность контрольных образцов в отсутствие исследуемых соединений принимали за 100% 120-, 100 Гис. 1. Общая формула исследованных пентаранов. 80 60 40 20выживаемость клеток. Статистическую обработку проводили с использованием программного обеспечения Statsoft Statistica и MS Excel. Результаты и обсуждение Результаты определения специфического связывания прегна^'-пентаранов I-VI с РП культур клеток HeLa и МНФК периферической крови представлена на рис. 2. Максимальная связывающая активность с клетками HeLa была у соединения V (88 %). Далее по убыванию следуют пентараны III (86 %), IV (82 %), VI(76 %) и II (61 %). Наименее активным из данного ряда соединений оказался препарат I. Его специфическое связывание составило 55 %. В случае с МНФК периферической крови максимальная связывающая активность с РП была у соединений I (104 %) и IV(103 %). Далее по убыванию следуют соединения III (99 %), V(77 %), VI (72 %) и II (67 %). Таким образом, все изученные прегна^'-пентараны проявляют достаточно высокое сродство к РП клеток HeLa и МНФК, вероятнее всего, за счет наличия дополнительного объемного заместителя в 16а,17а-поло-жениях стероидной молекулы, умножающего гидрофобные контакты лиганда с лигандсвязывающим доменом РП. В целом анализ связывания прегна^'-пентаранов с РП здоровых и опухолевых клеток показал снижение способности РП опухолевых клеток связывать прегна-D'-пентараны (р < 0,005). Структура исследованных прегна-Б-пентаранов Номер Стероид D' (16а,17а) X Двойная связь R R. Прогестерон - O 4,5 CH3 H2 I (992) 16а,17а-спиропентанопрогестерон O 4,5 CH3 H2 II(993) 3-оксим 16а,17а-циклогексанопрогестерона -(CH2)4- (E)NOH 4,5 CH3 H2 III(873) 19(Б)-19-метоксиимино-3,20-диоксо-16а,17ациклогексанопрегн-4-ен -(CHA- O 4,5 (E) CH=NOMe H2 Щк-100) 16а,17а-циклогексано-5аH-прегнан-3,20-дион -(CH2)4- O 5аH CH3 H2 V(806) 6а-метил-16а,17а-циклогексано-5аH-прегнан-3,20-дион -(CH2)4- O 5аH CH3 H, аШ3 VI(805) 6а-метил-16а,17а-циклогексано-5pH-прегнан-3,20-дион -(CH2)4- O H 5 CH3 H, аCH3 % 160-1 140120100806040200 — I II III IV V VI Ц HeLa Щ МНФК Рис. 3. Влияние прегна-Б'-пентаранов на жизнеспособность клеток HeLa и МНФК (в %). * - значение статистически достоверно отличается от такового в контрольной группе (100%; р < 0,01). Учитывая те факты, что жизнеспособность клеток МНФК под действием пентаранов не изменяется и связывание стероидов с РП фракции высокое, мы вправе были ожидать их влияние на функциональную активность МНФК, в частности на цитокинопродукцию. Результаты анализа влияния прегна-Б'-пентаранов на уровень продукции провоспалительного цитокина (ФНО-альфа) МНФК пациенток представлены на рис. 4. Как видно из представленных на рис. 4 данных, инкубация соединений IV и III с культурой клеток МНФ приводит к увеличению выработки ФНО-альфа на 25 и 20% соответственно. Остальные соединения не вызывают значимых изменений в секреции ФНО-альфа. Таким образом, соединения, которые наиболее активно связываются с РП МНФК, вызывают достоверное изменение цитокинопродукции в этих клетках. Корреляционный анализ подтвердил рецепторопосредованность эффекта исследуемых стероидов на цитокинопродукцию (r = 0,84). Таким образом, соединения IV и III не только тормозят рост опухолевых клеток, но и стимулируют продукцию иммунокомпетентными клетками цитокина, известного своей способностью подавлять пролиферацию опухолевых клеток [10]. Сила связывания лиганда с рецептором не дает информации о направленности его действия, поэтому в дополнение к рецепторному анализу необходим контроль изменения функции клетки-мишени. В классической фармакологической схеме определение направленности действия соединения осуществляется путем сравнения эффектов исследуемых соединений с эффектом известного агониста (в данном случае прогестерона) на интересующий параметр. В нашем исследовании прогестерон достоверно уменьшает уровень выработки ФНО-альфа в культуре МНФК, что совпадает с данными литературы [9, 11]. Соединения III и IV, напротив, стимулируют продукцию цитокина; это позволяет нам утверждать, что данные соединения проявляют антипрогестагенную активность, по крайней мере в данной экспериментальной системе. Полученные данные хорошо вписываются в общую характеристику селективных модуляторов прогестерона, которые в зависимости от клеточного и тканевого контекста способны проявлять как агонизм, так и антагонизм по отношению к прогестерону. м кг/мл Рис. 4. Концентрация ФНО-альфа в культуре МНФК периферической крови у пациенток с миомой матки (в мкг/мл). * - значение статистически достоверно отличается от контроля (р < 0,01). Заключение Сравнительное изучение свойств 6 представителей прегна-Б'-пентаранов позволило нам выявить два наиболее активных соединения - 19(Е)-19-метоксиимино-3,20-диоксо-16а,17а-циклогексанопрегн-4-ен (III-873) и 16а,17а-циклогексано-5аН-прегнан-3,20-дион (IV^ 100), перспективных для дальнейших доклинических испытаний. Указанные соединения при максимальном подавлении жизнеспособности клеток Hela не оказывают цитостатического действия на иммунокомпетентные клетки и стимулируют продукцию последними цитоток-сического цитокина ФНО-альфа. Перечисленные свойства этих соединений свидетельствуют об их потенциальной пользе в онкогинекологической практике.

About the authors

E. N Kareva

N.I. Pirogov Russian National Research Medical University

Email: elenakareva@mail.ru

I. Solomonovna SLevina

N. D. Zelinsky institute of organic chemistry

L. E Kulikova

N. D. Zelinsky institute of organic chemistry

O. S Gorenkova

Moscow Regional Scientific Institute for Obstetrics and Gynecology

A. E Manyakhina

Research and Production Company "Lytech"

N. A Kotsyubinskaya

N.I. Pirogov Russian National Research Medical University

D. A Tikhonov

N.I. Pirogov Russian National Research Medical University

References

Supplementary files