Morphofunctional characteristics of fibroblasts in peritumorous zone of renal cell carcinoma in different degrees of malignancy

Full Text

Полученные в последние десятилетия данные показывают, что прогрессия злокачественных опухолей не зависит исключительно от свойств раковых клеток, она также находится под влиянием клеток стромы опухоли [1]. По данным R. Kalluri и соавт. [2], ключевой детерминантой прогрессии рака являются фибробласты. Имеются работы, в которых показано, что генетические изменения в фибробластах могут предшествовать генетическим изменениям в эпителиальных клетках, что в конечном итоге и приводит к раку [3]. Ассоциированные со злокачественной опухолью фибробласты вызывают ускорение роста новообразования, инвазию опухолевых клеток в окружающие ткани и метастазиро-вание [4, 5]. Неопластические клетки взаимодействуют с фибробластами стромы посредством факторов роста и цитокинов. Фибробласты, ассоцированные с опухолью, также стимулируют ангиогенез опухоли, в частности се-кретируя ростковый фактор (TGFß), который активизируют эндотелиальные клетки и перициты [6, 7]. В то же время TGFß является еще и очень сильным митогеном для опухолевых клеток [8]. Возрастание числа активных фибробластов в опухоли является неблагоприятным фактором прогноза при раке различных локализаций [9, 10]. Так, при раке желудка количество фибробластов в опухоли коррелировало с размером опухолевого узла, глубиной инвазии, наличием метастазов в регионарные лимфатические узлы и отдаленных метастазов в печень и брюшину [11]. Активное изучение ассоциированных с опухолью фибробластов и понимание биомолекуляр-ных механизмов их влияния на опухолевые клетки могут сделать данные клеточные элементы мишенью при разработке новых методов противораковой терапии [12, 13]. Несмотря на определенные успехи в изучении роли фибробластов стромы опухоли, в литературе имеются лишь единичные работы, посвященные фибробластам, ассоциированным с перитуморозной зоной (ПЗ) опухоли, а работ, посвященных морфологическим и биомоле-кулярным характеристикам фибробластов ПЗ рака почки, в доступной литературе нами обнаружено не было. Цель исследования — изучить морфофункциональные особенности фибробластических элементов, ассоциированных с ПЗ рака почки, в зависимости от степени злокачественности опухоли. 12 фундаментальная наука - практическому здравоохранению Материал и методы Изучен операционный материал 33 больных почечно-клеточным раком (ПКР). Средний возраст пациентов составил 57,6±1,6 года. Мужчин было 17 (51,5%), женщин — 16 (48,5%). Степень злокачественности карцином оценивали по S. Fuhrman и соавт. (1982). Изученный материал включал 10 (30,3%) опухолей степени анаплазии G1; 11 (33,3%) — степени анаплазии G2; 6 (18,2%) опухолей степени анаплазии G3 и 6 (18,2%) — степени анаплазии G4. Материал фиксировали в 10% нейтральном забу-ференном формалине на протяжении 12—24 ч. Гистологические препараты окрашивали гематоксилином и эозином, на коллагеновые волокна по Ван-Гизону, на эластические волокна по Вейгерту, на нейтральные глю-козаминогликаны по Мак-Манусу и на кислые глюкоза-миногликаны (КГАГ) по Хейлу. Морфометрическое и микроспектрофотометриче-ское исследование ДНК проводили с использованием системы компьютерного анализа изображений, состоящей из микроскопа Leica DМЕ, цифровой камеры Leica EC3 (Leica Microsystems AG, Германия), персонального компьютера и программного обеспечения ВидеоТест — Морфология 5.2. Плоидометрию ДНК проводили на гистологических срезах, окрашенных по Фельгену. Среднее содержание ДНК в ядрах малых лимфоцитов принимали за диплоидное (2с) и использовали в качестве стандарта. Для получения стандарта в каждом срезе оценивали 25—30 лимфоцитов. В ядрах клеток фибробластического ряда ПЗ высчитывали индекс накопления ДНК (ИНДНК) в единицах плоидности (с). За ПЗ принимали непосредственно прилежащую к псевдокапсуле ткань опухоли, псевдокапсулу и ткань, расположенную за псевдокапсулой до неизмененной ткани почки. При морфометрическом исследовании определяли площадь, периметр, длину, ширину и фактор формы ядра клеток. Фактор формы определяли, как отношение минимального сечения ядра к максимальному. При факторе формы до 0,5 ядра считали удлиненными, больше 0,5 — округлыми. При просчете плотности распределения клеток фи-бробластического ряда и плотности распределения сосудов в ПЗ использовали количественный способ оценки Таблица 1 Морфологические параметры ядер клеток фибробластического ряда ПЗ в зависимости от степени анаплазии опухоли Параметр Степень GI—GII GIII—GIV Плотность распределения 77,3±3,0 109,2±4,9 Площадь ядра, мкм2 17,9±0,6* 37,9±1,3* Периметр ядра, мкм 22,65±0,5* 26,5±0,5* Длина ядра, мкм 10,1±0,2 11,0±0,2 Ширина ядра, мкм 2,6±0,05 4,7±0,1 Фактор формы ядра 0,3±0,01* 0,45±0,01* Количество AgNORs 1,3±0,1* 4,8±0,4* Плоидность ядра, с 2,9±0,1* 5,0±0,2* Примечание. * —p < 0,05. в абсолютных цифрах площади (0,73 мм2) при увеличении в 400 раз (оценивали не менее 6 полей зрения), а затем рассчитывали средний показатель. Для оценки плотности распределения сосудов в ПЗ использовали иммуногистохимический анализ с помощью антител к CD31 (мышиные, моноклональные, клон JC70A «Dako») в разведении не более 1:10, применяли систему визуализации Super Sensitive Polymer-HRP Detection System/DAB (BioGenex) с хромогеном DAB и последующей докраской ядер гематоксилином Майера. Подсчет производили, оценивая позитивно окрашенный эндотелий сосудов к CD31. Аргирофильные белки, ассоциированные с областью ядрышкового организатора выявляли по двухступенчатому методу Y. Daskal и соавт. в нашей модификации [14]. Высчитывали число гранул серебра (AgNORs) и число ядрышек на 1 ядро в 25—30 клетках фибробла-стического ряда. Ядрышки фибробластических элементов классифицировали в соответствии с морфофункциональной классификацией ядрышек П.В.Челидзе и О.В. Зацепиной [15]. Статистическую обработку материала проводили при помощи статистического пакета Statistica 6.0. Рис. 1. Фибробласты ПЗ опухолей GI--GII степеней анаплазии. а — небольшие ядра в клетках фибробластического ряда, б -- единичные крупные гранулы AgNORs (показаны стрелками) в клетках фибробластического ряда. Окраска по Ван-Гизону и серебрение по Y. Daskal. *400; ><1000. 13 РОССИЙСКИЙ ОНКОЛОГИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ, № 6, 2013 ‘ ^ 6. · . ·■ jS*- ·> ■' ; к* ' t. ' «С а· ф Y iZ .К \ * б Рис. 2. Фибробласты ПЗ опухолей GIII—GIV степени анаплазии. а — увеличение размеров ядер в клетках фибробластического ряда, б — возрастание числа AgNORs (показаны стрелками) в клетках фибробластического ряда. Окраска по ван-Гизону и серебрение по Y. Daskal. *400; х1000. При нормальном распределении данных при проверке статистических гипотез применяли методы параметрической статистики (t — test Стьюдента), а если полученные данные не соответствовали критериям нормального распределения (критерий Шапиро—Уилка W = 0,89, p <0,01), то применяли тест Колмогорова — Смирнова или U — тест Манна — Уитни. Данные считали достоверными при р < 0,05. Анализировались корреляционные связи между характеристиками ПЗ и морфофункциональными параметрами клеток фибробластического ряда с использованием коэффициента корреляции Пирсона. Результаты и обсуждение Результаты исследования показали, что в ПЗ опухолей GI—GII степени анаплазии средняя плотность распределения клеток фибробластического ряда составила 77,3±3,0 в 6 полях зрения. Ядра клеток ряда имели небольшие размеры, палочковидную, волнообразную форму и содержали преимущественно одно ядрышко кольцевидного типа (рис. 1, а). Среднее число ядрышек на 1 ядро составило 1,1±0,05 (рис. 1, б). Площадь ядра составила в среднем 17,9±0,6 мкм2, плоидность — 2,9±0,1 с и число AgNORs — 1,3±0,1 на 1 ядро (табл. 1). Такие клетки нами были отнесены к зрелым неактивным фиброцитам. Данные клетки располагались среди плотной ШИК-положительной соединительной ткани. В ПЗ опухолей GIII—GIV степени анаплазии средняя плотность распределения клеток фибробластиче-ского ряда составила 109,2±4,9 в 6 полях зрения. Клетки имели крупные удлиненные ядра. Ядра клеток содержали 1—2 ядрышка, в среднем 1,6±0,16 на 1 ядро, при этом отмечалось многообразие морфологических типов ядрышек (рис. 2, а, б). Встречали ядрышки кольцевидного, нуклеолонемного типов и переходные между ними формы. Площадь ядра составила 37,9±1,3 мкм2, плоидность ядра — 5,0±0,2 и число AgNORs — 4,8±0,4 на 1 ядро (см. табл. 1). Данные клетки в большом количестве встречались в участках ПЗ, богатых КГАГ. Такие клетки нами были отнесены к активно синтезирующим коллаген и пролиферирующим фибробластам. При микроспектрофотометрическом исследовании количества ДНК в ядрах фиброцитов ПЗ опухолей сте пени анаплазии GI—GII содержание ДНК составило 2,9±0,1 с. Гистограмма распределения клеток по количеству ДНК характеризовалась высокими пиками клонов с уровнями ДНК 3 и 4 с (рис. 3). При плоидометрии в ядрах фибробластов ПЗ степени анаплазии опухолей GIII—GIV было обнаружено увеличение среднего содержания ДНК до 5,0±0,2 с по сравнению с опухолями GI—GII. Гистограмма, характеризующая распределение ядер клеток по количеству ДНК была растянута вправо. Другими особенностями гистограммы являлись отсутствие клеток содержащих 1 с ДНК и высоких пиков клеток содержащих 2 и 3 с ДНК, многовершинность гистограммы, которая отражала широкую вариабельность ядер фибробластов ПЗ опухолей высоких степеней злокачественности.Таким образом, возрастание среднего содержания ДНК опухолей степеней анаплазии G3—G4 сопровождалось нарастанием гетерогенности ядер клеток по содержанию генетического материала, явлениями анеуплоидии и полиплоидии, с возникновением клонов, содержащих 7, 8, 9, 11 и 12 с (см. рис. 3) Нами были исследованы коррелятивные взаимосвязи между морфологическими характеристиками ПЗ и мор- Таблица 2 Коррелятивные взаимосвязи параметров клеток фибробластического ряда с морфологическими характеристиками ПЗ ПЗ Параметр ширина выраженность склероза степень ангиогенеза ПЗ Плотность распределения фибробластов 0,62 0,51 0,21 Длина ядра, мкм 0,1 -0,07 -0,34 Ширина ядра, мкм -0,12 -0,18 -0,25 Площадь ядра, мкм2 0,51 0,39 0,33 Периметр ядра, мкм 0,27 0,09 -0,17 Плоидность ядра, с 0,55 0,37 0,23 Фактор формы ядра 0,53 0,52 0,53 Количество AgNORs 0,65 0,49 0,33 14 ФУНДАМЕНТАЛЬНАЯ НАУКА - ПРАКТИЧЕСКОМУ ЗДРАВООХРАНЕНИЮ 45I 4035302520151050 — 1с 4с 5с 6с G1-2 7с G3-4 Рис. 3. Характер распределения ДНК в ядрах фибробластов в перитуморозной зоне опухолей различной степени анаплазии. По оси абсцисс — количество ДНК (в единицах плоид-ности, с), по оси ординат — количество клеток (в %). фофункциональными параметрами фибробластических элементов ПЗ (табл. 2). Результаты изучения коррелятивных взаимосвязей показали, что ширина ПЗ была взаимосвязана с числом AgNORs в ядрышках (г = 0,65; p = 0,0001), плотностью распределения клеток (г = 0,62; p = 0,0001), площадью ядер (г = 0,51; p = 0,002), плоидностью ядер (г = 0,55; p = 0,001) и фактором формы ядер клеток фибробластиче-ского ряда (г = 0,53; p = 0,001). Выраженность склероза ПЗ была взаимосвязана с фактором формы ядер (r = 0,52; p = 0,002), плотностью распределения клеток (r = 0,51; p = 0,002), числом AgNORs в ядрышках (г = 0,49; p = 0,015), площадью ядер (г = 0,39; p = 0,025) и плоидностью ядер фибробластов (г = 0,37; p = 0,04). Со степенью ангиогенеза ПЗ коррелировали ширина ядра (г = - 0,34; p = 0,04), площадь ядра (г = 0,33; p = 0,045), количество AgNORs в ядрышках (г = 0,33; p = 0,045) и фактор формы (г = 0,53; p = 0,04). Таким образом, обнаружено, что морфометрические и биомолекулярные характеристики клеток фибробла-стического ряда ПЗ рака почки были взаимосвязаны со степенью анаплазии опухоли. В ПЗ опухолей степеней анаплазии GIII—GIV по сравнению с опухолями GI— GII в ядрах фибробластов отмечали возрастание морфометрических параметров ядра, плоидности и увеличение активности ядрышковых организаторов, что может свидетельствовать об активизации пролиферативных процессов, рибосомального синтеза и о возрастании синтетической активности клеток. Результаты исследования морфофункциональной активности фибробла-стов показали, что возрастание изученных параметров приводило к расширению ПЗ и в то же время вызывало увеличение выраженности склеротических процессов в ней. Нам кажется интересным тот факт, что изученные параметры фибробластов были взаимосвязаны и с выраженностью ангиогенеза в ПЗ. При возрастании ширины, площади, фактора формы ядра и числа AgNOR в ядрышках фибробластов, ассоциированных с ПЗ, неоангиоге-нез в ПЗ был более выражен.

About the authors

T. M Cherdantseva

Email: drakon@agmu.ru

I. P Bobrov

V. V Klimachev

V. M Bryuhanov

A. F Lazarev

A. M Avdalyan

A. Yu Dolgatov

N. S Samartsev

References

Supplementary files