From 2D to 3D in vitro models of nasal septal squamous cell carcinoma: tumor-associated gene expression under normal conditions and after neutron exposure

Full Text

ОБОСНОВАНИЕ

Злокачественные опухоли полости носа являются достаточно редкими: данная локализация встречается менее чем у 2% пациентов с плоскоклеточным раком головы и шеи [1]. В отличие от других локализаций, развитие новообразований в носовой полости связывают не с инфицированием онковирусами или чрезмерным употреблением алкоголя и табака, а с длительным воздействием на людей канцерогенов в виде аэрозолей, например при работе на предприятиях по деревообработке, выделке кож, производству тканей, обработке металлов и т.д. Именно поэтому для in vivo моделирования данной нозологии чаще всего используют ингаляционное или пероральное введение грызунам различных химических индукторов опухолей [2], что релевантно воспроизводит механизм развития этого типа рака в отдельных социальных группах. Частота развития опухолей носовой полости и околоносовых пазух является важным показателем для мониторинга условий и охраны труда, оценки опасностей и уровня профессиональных рисков на некоторых специфических производствах [1].

Хирургические методы лечения рака головы и шеи ограничены сложным анатомическим строением данной области [3], а близость расположения критически важных для выживания пациента органов затрудняет лучевую терапию [4]. Развитие методов химио- и радиотерапии привело к росту показателя пятилетней опухоль-специфической выживаемости больных с раком полости носа до 67,1% [5], хотя есть данные о том, что рецидивы этой опухоли возможны и в более отдалённый период времени [6, 7]. Опухоли полости носа считаются одной из наиболее сложных локализаций с точки зрения дозиметрического планирования в лучевой терапии [7]. Проведённый метаанализ показал, что облучение частицами пациентов с раком носовой полости более эффективно, чем использование фотонов [8], однако лучевая терапия таких больных зачастую сопровождается серьёзными осложнениями, включающими снижение зрения, сосудистые нарушения сетчатки и лучевой некроз головного мозга [9]. Более того, было выявлено, что общая выживаемость и выживаемость без прогрессирования опухоли у пациентов с новообразованиями носовой полости и околоносовых пазух намного выше при сочетании хирургического лечения и лучевой терапии, чем у пациентов с неоперабельной опухолью, которые подвергались только лучевой терапии (90 и 70% против 24 и 11% соответственно) [9]. Авторы исследования предлагают более активно использовать комбинирование лучевой и химиотерапии для пациентов с неблагоприятным прогнозом.

Поиск новых подходов к лечению рака носовой полости значительно затруднён тем, что среди обширного списка иммортализованных клеточных линий опухолей органов головы и шеи только около 4% (7 из 171) были выделены из области носовой полости и околоносовых пазух [10]. В Американской коллекции типовых культур (АТСС), крупнейшем мировом центре стандартизованных биологических ресурсов, хранятся лишь две линии плоскоклеточного рака носовой полости, выделенных у крысы (линия FAT 7) и человека (линия RPMI-2650).

Клеточная линия RPMI-2650 была получена в 1962 году из плеврального выпота 52-летнего мужчины с плоскоклеточным раком носовой перегородки [11]. В настоящее время RPMI-2650 (в виде как 2D-культур, так и сфероидов) активно используют для моделирования эпителиального барьера носовой полости и верхних дыхательных путей при изучении аллергических и вирусных ринитов [12, 13] и оценке эффективности проникновения лекарственных средств [14–16], в том числе предназначенных для доставки в головной мозг [17]. При этом опубликовано крайне мало работ по изучению биологических эффектов, вызванных облучением опухолевых клеток RPMI-2650. В работе A. Danielsson и соавт. было показано, что радиочувствительность клеток RPMI-2650 повышается в присутствии пентоксифиллина (агента, способствующего накоплению клеток в G2/M фазе клеточного цикла) при облучении как с высокой, так и с низкой мощностью дозы [18]. В работе С. Emer и соавт. было обнаружено, что суперпарамагнитные наночастицы, покрытые 3-аминопропил-триметоксисиланом, не повышают цитостатический и цитотоксический эффекты облучения в дозах от 2 до 8 Гр для клеток RPMI-2650 в отличие от некоторых других линий плоскоклеточного рака [19]. В недавнем исследовании сравнивали свойства внеклеточных везикул, полученных из материала пациентов с радиоиндуцированным мукозитом и из клеток RPMI-2650, облучённых в дозе 12,5 и 25 Гр [20]. Упомянутые выше исследования были выполнены на 2D-адгезивных культурах клеток RPMI-2650, при этом известно, что 3D-условия культивирования значительно повышают устойчивость клеток рака головы и шеи к химио- и радиотерапии за счёт изменения сигнальных путей, профиля экспрессии генов и условий взаимодействия клеток между собой, обеспечивая релевантность многоклеточных объёмных структур в качестве in vitro моделей опухолевой ткани [21, 22].

ЦЕЛЬ

Оценка изменения профиля экспрессии опухоль-ассоциированных генов при переходе от 2D- к 3D-модели плоскоклеточного рака носовой перегородки человека и сравнение ответа опухолевых клеток в составе моделей на однократное облучение нейтронами.

МЕТОДЫ

Дизайн исследования

Дизайн исследования включал три этапа. На первом этапе проводили морфологическую и фенотипическую характеристику 2D- и 3D-моделей плоскоклеточного рака носовой перегородки человека из клеток линии RPMI-2650. На втором этапе изучали изменение профиля экспрессии опухоль-ассоциированных генов в клетках RPMI-2650 при переходе от 2D- к 3D-условиям культивирования. На третьем этапе сравнивали профили экспрессии опухоль-ассоциированных генов в 2D- и 3D-моделях плоскоклеточного рака носовой перегородки в ответ на однократное облучение нейтронами в дозе 10 Гр.

Условия проведения и продолжительность исследования

Исследование проводилось на базе НИИ морфологии человека имени академика А.П. Авцына ФГБНУ «Российский научный центр хирургии имени академика Б.В. Петровского», НИИ молекулярной и клеточной медицины ФГАОУ ВО «Российский университет дружбы народов имени Патриса Лумумбы» и МРНЦ им. А.Ф. Цыба, филиала ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России. Продолжительность исследования: февраль — сентябрь 2025 г.

2D-клеточная линия RPMI-2650

Клеточная линия RPMI-2650 была получена из коллекции клеточных культур позвоночных ФГБУ ИНЦ РАН (Санкт-Петербург, Россия). Для культивирования использовали среду DMEM/F12 («ПанЭко», Россия) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (HyClone, США), 1% пенициллина-стрептомицина («ПанЭко», Россия) и 2 мМ L-глутамина («ПанЭко», Россия) при стандартных условиях (37 °C, 5% CO₂). Замену среды на свежую проводили каждые 2–3 дня. После достижения 70–80% конфлуентного монослоя клетки открепляли от подложки 0,25% трипсином-ЭДТА («ПанЭко», Россия) и рассаживали в 4–5 раз в новую культуральную посуду. Отсутствие контаминации культуры бактериями родов Mycoplasma и Acholeplasma подтверждали с помощью наборов реактивов MycoReport и ExtractDNA Blood & Cells («Евроген», Россия) в соответствии с протоколами производителя.

Клетки на этапе экспоненциального роста использовали для последующих экспериментов.

Прижизненное наблюдение за культурами клеток осуществляли с помощью инвертированного фазово-контрастного микроскопа Axiovert 40 CFL (Zeiss, Германия) и программного обеспечения AxioVs40 4.8.2.0 (Zeiss, Германия).

Получение 3D-сфероидов из клеток RPMI-2650

Клетки открепляли от поверхности культурального пластика 0,25% трипсином-ЭДТА («ПанЭко», Россия), оценивали жизнеспособность с помощью автоматического счётчика TC-20 (Bio-Rad, США) и переносили в 90-мм чашки Петри с ультранизкой адгезией (Corning, США) из расчёта 100 тысяч живых клеток на 1 мл ростовой среды. В экспериментах использовали сфероиды через 2 суток после начала сборки.

Иммуноцитохимическое окрашивание

Адгезивную 2D-культуру, выращенную в 35-мм чашках Петри с покровным стеклом, фиксировали ледяным метанолом и охлаждённым до +4 °C 2% параформальдегидом. Криосрезы сфероидов толщиной 7 мкм изготавливали с помощью микротома-криостата Dakewe 6250 (Dakewe, КНР), используя стёкла SuperFrost Plus Gold (Menzel, Германия). Антитела к виментину (GB111925, Servicebio, Китай) и кератину 17 (ab53707, Abcam, Великобритания) разводили 1 к 200 буфером для разведения антител (Servicebio, Китай), наносили на стёкла и инкубировали во влажной камере при +4 °C в течение ночи. Затем стёкла отмывали и инкубировали с антителами, конъюгированными с флуоресцентной меткой FITC (ab97050, Abcam, Великобритания) в темноте при комнатной температуре в течение 1 часа. Ядра окрашивали раствором 0,1 мкг/мл DAPI (Servicebio, Китай) в течение 10 минут при +37 °C. Стёкла заключали в монтирующую среду Aqua-Poly-Mount (Polysciences, Италия). Съёмку препаратов проводили с помощью прямого микроскопа Leica DM 4000 В и программного обеспечения LAS AF v.3.1.0 build 8587.

Облучение опухолевых моделей нейтронами

В пилотных экспериментах было определено, что клетки линии RPMI-2650 хорошо переносят высокие дозы однократного облучения, что соответствует приведённым выше литературным данным. В соответствии с рекомендациями сотрудников отдела радиационной биофизики МРНЦ им. А.Ф. Цыба, филиала ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России, для оценки краткосрочных биологических эффектов нейтронного облучения была выбрана доза 10 Гр. Монослойную культуру клеток RPMI-2650 облучали в культуральных флаконах 25 см², суспензию сфероидов облучали в 1,8-мл криопробирках. Контрольные модели транспортировали к месту проведения эксперимента при тех же условиях, что и облучаемые образцы, но в отдельных транспортных термоконтейнерах, чтобы избежать остаточного воздействия ионизирующего облучения. Облучение проводили на базе лаборатории радиационной биофизики МРНЦ имени А.Ф. Цыба (филиала ФГБУ «НМИЦ радиологии» Минздрава России). В качестве источника нейтронного облучения использовали генератор нейтронов НГ-14 (разработан в ВНИИА им. Н.Л. Духова, Москва). Для облучения моделей нейтронами в дозе 10 Гр рассчитывали время экспозиции, учитывая геометрию объектов и расстояние от источника нейтронов. Зону интереса располагали таким образом, чтобы расчётное значение флюенса на объекте составило 1,65×10¹³ нейтронов, что равно поглощённой дозе 5 Гр (эквивалентно 10 Гр с учётом коэффициента относительной биологической эффективности), среднее время облучения составило 1650 с при выходе нейтронов 1,00×10¹⁰ н/с (мощность дозы 3,031 мГр/с). Контроль за полученной дозой осуществляли по мониторной камере и радиометру быстрых нейтронов на основе синтетического алмаза. Исследование проводили с использованием 2 биологических и 3 технических повторов.

Анализ профиля экспрессии опухоль-ассоциированных генов в клетках RPMI-2650

Относительную экспрессию генов определяли методом полимеразной цепной реакции в реальном времени с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР-РВ). Через 48 часов после начала сборки сфероидов и через 24 часа после облучения клетки промывали фосфатно-солевым буфером, рН=7,2–7,4 («ПанЭко», Россия) для удаления питательной среды с сывороточными белками. Клетки лизировали с помощью буфера MagZol (Biolab, Венгрия), переносили в пробирки типа эппендорф и замораживали при -80 °C. Тотальную РНК выделяли с использованием фенол-хлороформного метода согласно протоколу производителя. Контроль качества и концентрацию РНК определяли с помощью нанофотометра NanoPhotometer N50 (Implen, Германия). Синтез комплементарной цепи ДНК выполняли, используя коммерческий набор MMLV RT («Евроген», Россия), по следующему протоколу: тотальную РНК инкубировали с праймерами при 70 °C (2 мин), затем переносили к реакционной смеси 5× буфер, dNTP, DTT и MMLV-ревертаза, инкубировали 50 мин (37 °C) и 10 мин (70 °C). Концентрацию кДНК контролировали с помощью нанофотометра. С полученными кДНК ставили ПЦР с помощью набора реактивов qPCRmix-HS SYBR, содержащего флуоресцентный интеркалирующий краситель Sybr Green I («Евроген», Россия): в состав реакционной смеси (25 мкл), помимо буфера 5X qPCRmix-HS SYBR, входили кДНК, специфичные праймеры. Выбранные праймеры (табл. 1) были синтезированы фирмами «ГенТерра» или «Евроген» (Россия). ПЦР-РВ выполняли с помощью амплификатора DTprime («ДНК-технология», Россия) по следующему протоколу: предварительная денатурация (95 °C / 5 мин), отжиг праймеров, 40 циклов (94 °C / 10 с, 62 °C/12 с), элонгация (72 °C/20 с). Относительный уровень экспрессии таргетных генов был рассчитан путём нормирования на уровень экспрессии гена домашнего хозяйства (референсного гена) GAPDH. Для оценки уровня экспрессии использовали метод относительного количественного определения 2-ΔΔct.

 

Таблица 1. Последовательности праймеров

Table 1. Sequences of primers

Ген	5’-праймер	3’-праймер
VIM	TCAATCGGCGGGACAGCAG	GGACGAGGACACGGACCT G
CDH1	ACTGATGCTGATGCCCC AA	TGTACTGCTGCTTGGCCTCA
CD44	AGGAGCAGCACTTCAGGAGG	AGAGGTCCTGTCCTGTCCAA
KRT5	AGGAGTTGGACCAGTCAACAT	TGGAGTAGTAGCTTCCACTGC
KRT7	GAGATCGCCACCTACCGCAA	GCATTGCTGCCCATGGTTCC
KRT8	TCCTCAGGCAGCTATATGAAGAG	GGTTGGCAATATCCTCGTACTGT
KRT10	AACTCACATCAGGGGGAGCC	GATGTCAGCCTCCACGCTCT
KRT17	AGATTGCCACCTACCGCCG	AGTCCTCAGCGGGTGGTCTG
KRT18	TCGCAAATACTGTGGACAATGC	GCAGTCGTGTGATATTGGTGT
KRT19	GGTGAAGATCCGCGACTGGT	GCAGAGCCTGTTCCGTCTCA
PIK3CA	TTCCGGGGGATTGTAGGCTC	GGTCGTGGAGGCATTGTTCT
YAP1	CAGCAACTCCAACCAGCAGC	GAGTCCCACCATCCTGCTCC
HIF1A	GCCCATTCCGCGTCTGAGT	ACTTGTGGGTGCTGGCACTG
PTEN	CCCAGTCAGAGGCGCTATGT	CCGTCGTGTGGGTCCTGAAT
NOTCH1	CCCACTCATTCTGGTTGTCG	CGCCTTTGTGCTTCTGTTCT
TIMP1	CCTTCCAGGTGTTTCCCTGTT	TCCGGAAGAAAGATGGGAGTG
TIMP2	GACCCACAAGGAGATTGGGG	CGGAGACGACTGGTCTATGC
MMP9	AGGTTCGACGTGAAGGCG	GCCGTCCTGTACTGAAGGAG
MMP2	CGCTACGATGGAGGCGCTAA	GGGGCAGCCATAGAAGGTGT
TP63	GTGTTGGAGGGATGAACCGC	CGCTTCGTACCATCACCGTTC
TP53	GTGCTTTCCACGACGGTGAC	CATCCATTGCTTGGGACGGC
MKI67	ACTTTGGGTGCGACTTGACG	TCGACCCCGCTCCTTTTGAT
CDKN2A	AGTTACGGTCGGAGGCCGAT	TGGTTACTGCCTCTGGTGCC
TGFB1	AGCCTGAGGCCGACTACTA	GCTGAGGTATCGCCAGGAA
TGFBR1	GGCCCCTGAAGTTCTCGATG	GCCATTACTCTCAAGGCTTCAC
GAPDH	GCACCGTCAAGGCTGAGAAC	TGGTGAAGACGCCAGTGGA

 

Этическая экспертиза

Настоящее исследование не предполагает участие людей, использование биоматериалов человека (биологических жидкостей и тканей) или лабораторных животных и не требует прохождения экспертизы в Локальном этическом комитете (ЛЭК) в соответствии с Положением о ЛЭК РНЦХ от 13.11.2020 г.

Статистический анализ

Количественные показатели оценивали на предмет соответствия нормальному распределению с помощью теста Шапиро–Уилка. В связи с несоответствием данных условиям применения t-критерия Стьюдента использовали U-критерий Манна–Уитни. Различия считали статистически значимыми при p <0,05 для всех тестов. Анализ данных и построение графиков проводили с использованием программы GraphPad Prism v.8.4.3. (GraphPad Software LLC, США). Данные представляли в виде среднего и стандартных отклонений или в виде тепловой карты кратности изменений параметра.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Морфологическая и фенотипическая характеристика 2D- и 3D-моделей

Линия RPMI-2650 была представлена очень мелкими клетками эпителиального фенотипа с округлой, веретеновидной или полиморфной формой, которые в условиях 3D-культивирования начинали компактизацию уже через 2–4 часа, а на вторые сутки формировали стабильные сфероиды. Иммуноцитохимическое окрашивание выявило наличие в клетках виментиновых и кератин 17+ промежуточных филаментов (рис. 1).

 

Рис. 1. Морфология 2D- и 3D-клеточных моделей плоскоклеточного рака носовой перегородки. 3D-модель представлена сфероидами через 48 часов после начала культивирования в условиях ультранизкой адгезии. Фазово-контрастная и флуоресцентная микроскопия. Ядра клеток докрашены DAPI. Масштабный отрезок 100 мкм.

Fig. 1. 2D and 3D cell models of squamous cell carcinoma of the nasal septum. The 3D model is represented by spheroids 48 hours after the start of culture under ultra-low adhesion conditions. Phase-contrast and fluorescence microscopy. Cell nuclei are counterstained with DAPI. Scale bar, 100 μm.

 

Изменение профиля экспрессии опухоль-ассоциированных генов в клетках RPMI-2650 при переходе от 2D- к 3D-модели

При переходе от 2D- к 3D-условиям культивирования относительная экспрессия генов KRT5, KRT7, KRT8, KRT18, KRT19, YAP1, HIF1A, PTEN, NOTCH1, TIMP1, MMP9, TP53, MKI67, CDKN2A и TGFBR1 в клетках RPMI-2650 значимо не изменялась. В то же время мы наблюдали подавление генов кератинов 17 и 10 в 6,9 раза, а также повышение уровня относительной экспрессии генов CDH1 в 4,9 раза, CD44 в 4,4 раза, VIM в 12,4 раза, TP63 в 3,2 раза, PIK3CA в 2,7 раза, TGFB1 в 3,8 раза, MMP2 в 13,1 раза и TIMP2 в 35 раз (рис. 2).

 

Рис. 2. Изменение относительной экспрессии опухоль-ассоциированных генов в клетках RPMI-2650 при переходе от 2D- к 3D-условиям культивирования. Данные представлены в виде медиан и межквартильных размахов. Значения p представлены на графиках.

Fig. 2. Changes in the relative expression of tumor-associated genes in RPMI-2650 cells upon transition from 2D to 3D culture conditions. Data are presented as medians and interquartile ranges. P-values are shown in the graphs.

 

Изменение профиля экспрессии опухоль-ассоциированных генов в 2D- и 3D-моделях плоскоклеточного рака носовой перегородки после облучения нейтронами

Через 24 часа после однократного облучения нейтронами в дозе 10 Гр относительный уровень экспрессии большинства исследованных генов изменялся менее чем в 3 раза независимо от способа культивирования опухолевых моделей. В то же время мы наблюдали однонаправленное радиоиндуцированное повышение CDKN2A в 2D- и 3D-моделях (в 4,7 и 6,7 раза соответственно), рост экспрессии KRT10 в 5 раз и TIMP1 в 4,5 раза только в сфероидах, а также рост TIMP2 в 6,8 раза, TP63 в 6,5 раза и CD44 в 9,3 раза только в монослойной культуре. Наиболее интересным оказалось наблюдение о разнонаправленном изменении относительного уровня экспрессии гена виментина: в облучённой 2D-опухолевой модели он возрастал почти в 22 раза, а в облучённой 3D-модели, напротив, падал в 7 раз (рис. 3).

 

Рис. 3. Тепловая карта, отображающая log₂-кратности изменения уровня экспрессии опухоль-ассоциированных генов в облучённых 2D- и 3D-моделях плоскоклеточного рака носовой перегородки относительно контрольных (необлучённых) моделей.

Fig. 3. Heat map displaying log₂-fold changes in the expression levels of tumor-associated genes in irradiated 2D and 3D models of squamous cell carcinoma of the nasal septum relative to control (non-irradiated) models.

 

ОБСУЖДЕНИЕ

Клетки линии RPMI-2650 демонстрировали смешанный фенотип: иммуноцитохимическое (ИЦХ) окрашивание выявило одновременное присутствие кератина 17, характерного для плоскоклеточного рака, и виментиновых промежуточных филаментов, что свидетельствует о прошедшем эпителиально-мезенхимальном переходе [23]. Такая картина объясняется тем, что линия RPMI-2650 выделена не из первичной опухоли, а из метастаза рака носовой перегородки в лимфатический узел. Похожими свойствами, согласно данным открытой базы The Human Protein Atlas [24], обладают некоторые другие линии плоскоклеточного рака, например HSC-3 и HSC-4, выделенные из метастаза рака языка, или линия Detroit 562, выделенная из метастаза рака глотки. Важно заметить, что лишь часть клеток в составе 2D- и 3D-моделей содержала кератин 17+ филаменты, при этом количественный подсчёт доли кератин 17+ клеток не имел практического значения, так как уровень интенсивности флуоресцентного сигнала значительно колебался между различными исследуемыми областями 2D-культуральной подложки или сфероидами. При окрашивании криосрезов в части сфероидов флуоресцентный сигнал визуально казался интенсивнее, чем в монослое клеток, однако это может быть связано с отличием в методиках фиксации (монослой клеток фиксировали метанолом и параформальдегидом, для сфероидов не использовали химических фиксаторов) и толщиной образца (монослой распластанных клеток против криосреза плотно упакованных клеток в составе сфероида).

Изменения фенотипических, физиологических и механических свойств опухолевых клеток, обусловленные принципиально иной структурой межклеточных взаимодействий при переходе от 2D- к 3D-условиям культивирования, были подтверждены различными исследовательскими группами, в том числе работавшими с моделями плоскоклеточного рака головы и шеи. Например, формирование сфероидов из опухолевых линий, полученных из языка, десны, глотки и гортани, приводило к повышению в них экспрессии CDH1, кодирующего Е-кадгерин, во всех 5 исследованных линиях, кратность увеличения варьировала от 1,4 до 8,8 раза [25], что согласуется с нашими данными, показавшими рост CDH1 в 5,4 раза в клетках RPMI-2650 после изменения условий культивирования. Одновременное повышение уровня экспрессии генов Е-кадгерина и виментина, выявленное нами, было ранее обнаружено в сфероидах, полученных из раковых линий кишечника НТ-29 и СаСо2 [26]. При этом следует отметить, что в других исследованиях встречаются противоречивые данные об изменении экспрессии этих двух генов при сравнении 3D-модели и монослойной культуры: повышение CDH1 и снижение VIM в клетках рака простаты [27] или подавление CDH1 и рост VIM в клетках рака яичника [28] и желудка [29].

Интересно, что экспрессия генов, кодирующих мажорные (характерные для линии RPMI-2650) кератины 5, 7, 8, 18, 19, не изменялась, а уровни KRT17 и KRT10 в сфероидах значимо снижались. Кератин 17+ промежуточные филаменты присутствуют во многих опухолях эпителиального происхождения, обеспечивая рост опухоли за счёт стимуляции клеточной пролиферации, миграции и интенсивного поглощения глюкозы [30]. Высокий уровень экспрессии гена KRT17 коррелирует с плохим прогнозом при раке молочной железы, яичника, поджелудочной железы, шейки матки и ротовой полости [31], в том числе за счёт повышения устойчивости опухолей органов головы и шеи к иммунотерапии [32]. Совсем недавно было показано, что кератин 10 также играет важную роль в прогрессии плоскоклеточного рака головы и шеи: нокдаун гена KRT10 подавлял способность клеток к миграции и инвазии, а также снижал их радиоустойчивость [33]. Таким образом, при переходе от 2D- к 3D-модели рака носовой перегородки мы наблюдали на транскриптомном уровне перестройку элементов цитоскелета — сохранность мажорных кератинов и частичную замену кератин 10+ и кератин 17+ промежуточных филаментов виментиновыми, что требует дальнейшего изучения. В целом же такое неравномерное распределение белков виментина и кератина 17 в RPMI-2650, выявляемое с помощью ИЦХ окрашивания, а также кратное изменение уровня экспрессии кодирующих их генов в ответ на изменение условий культивирования или облучение соотносятся с данными литературы, свидетельствующими о высокой эпителиально-мезенхимальной пластичности этой линии клеток [34].

Перестройка цитоскелета опухолевых клеток всегда ассоциирована с их миграционной активностью. Баланс между матриксными металлопротеиназами и их тканевыми ингибиторами также является критическим фактором ремоделирования внеклеточного матрикса, разрушения базальной мембраны и последующей инвазии опухолевых клеток. В условиях нашего эксперимента уровень экспрессии генов вырос для пары MMP2-TIMP2, связанной с активацией TGFbeta-Smad сигнального пути [35], при этом уровень экспрессии пары MMP9-TIMP1 не изменился. Важно заметить, что исходный уровень MMP2 в клетках RPMI-2650 был почти в 150 раз выше, чем MMP9, что соответствует современным представлениям о том, что MMP2 конститутивно продуцируется клетками, тогда как MMP9 является индуцируемым ферментом [36].

Экспрессия гена TP63 повышена в 88% всех плоскоклеточных карцином. Продукт гена может быть представлен как минимум шестью изоформами белка р63, при этом в опухолях эпителиального происхождения преобладает изоформа ΔNp63, положительно коррелирующая с метастатическим потенциалом и устойчивостью к терапии [37]. Изоформа ΔNp63 стимулирует транскрипцию гена, кодирующего клеточный поверхностный антиген CD44, который участвует в регуляции межклеточных взаимодействий, клеточной адгезии и миграции [37]. В трёхмерной культуре RPMI-2650 мы наблюдали согласованное повышение экспрессии TP63 в 3,4 раза и CD44 в 4,2 раза по сравнению с 2D-моделью опухоли. Похожие результаты были получены ранее для CD44 на моделях рака молочной железы [38] и колоректального рака [39].

Повышенная экспрессия генов TP63 и CD44 является негативным прогностическим маркёром у пациентов с плоскоклеточным раком головы и шеи, в том числе за счёт реализации механизма лекарственной устойчивости, активируемого связыванием рецептора CD44 и гиалуроновой кислоты [40]. Ещё одним негативным маркёром считается каталитическая субъединица альфа фосфатидилинозитол-3-киназы, кодируемая геном PIK3CA: повышение экспрессии этого гена положительно коррелирует с частотой рецидивов опухоли [41], а также способствует прогрессии и метастазированию плоскоклеточного рака [42].

Опухоли головы и шеи относятся к группе радиоустойчивых новообразований, что приводит к высокой частоте рецидивов после окончания лучевой терапии [43]. В настоящее время накоплена значительная база экспериментальных данных, однозначно подтверждающих более высокую устойчивость трёхмерных моделей опухолей головы и шеи к химио- и радиотерапии по сравнению с монослойными культурами [21, 25]. Предполагается, что результаты экспериментальных исследований, полученные при облучении 2D-опухолевых культур, релевантны лишь в малой степени, что привело к накоплению несоответствий между ожидаемыми и фактическими результатами лучевой терапии, а значит, новым золотым стандартом доклинической радиоонкологии должны стать более сложные 3D-модели [43].

В настоящем исследовании мы сфокусировались на изменении профиля экспрессии опухоль-ассоциированных генов, которые могли бы обеспечить более высокую радиорезистентность трёхмерной опухолевой модели плоскоклеточного рака носовой перегородки. К нашему удивлению, после облучения нейтронами уровень экспрессии 18 из 26 исследованных генов изменялся лишь незначительно в обоих вариантах модели. Общим для облучённых 2D- и 3D-моделей стало значительное повышение экспрессии гена-онкосупрессора CDKN2A, продукты которого участвуют в регулировании клеточного цикла. В первичной опухолевой ткани и клеточных линиях рака головы и шеи этот ген часто мутирован: мутации обнаружены в 4 из 5 линий особой панели, рекомендуемой Американской коллекцией типовых культур для изучения этого типа рака. Данные о функциональной сохранности гена CDKN2A в линии RPMI-2650 отсутствуют в современной литературе, однако известно, что более высокий уровень экспрессии этого гена является благоприятным прогностическим маркёром для пациентов с плоскоклеточным раком головы и шеи [44], поэтому повышение CDKN2A в опухолевых клетках под действием нейтронов может рассматриваться как один из механизмов реализации терапевтического эффекта.

Повышение экспрессии гена KRT10 в трёхмерной модели под действием нейтронов выявлено нами впервые. В нашем более раннем исследовании мы показали, что данный белок промежуточных филаментов характерен для клеток поверхностного слоя нормального многослойного эпителия, а также для высокодифференцированных опухолей головы и шеи, тогда как в умеренно дифференцированных опухолях встречаются лишь единичные KRT10+ клетки [45]. Данные об изменении экспрессии этого гена в клетках под действием корпускулярного ионизирующего излучения в научной литературе отсутствуют.

Интересно, что в облучённой 3D-модели плоскоклеточного рака повышалась экспрессия TIMP1, тогда как в монослойной культуре — TIMP2. Считается, что высокий уровень обоих эндогенных ингибиторов протеиназ подавляет опухолевый рост, а значит, радиоиндуцированное повышение экспрессии этих генов может быть рассмотрено как благоприятный фактор [46]. При исследовании осложнений реконструктивной хирургии у пациентов с плоскоклеточным раком ротовой полости было обнаружено, что экспрессия TIMP1 детектируется в 38,7% необлучённых трансплантатов и в 80,3% трансплантатов пациентов, ранее прошедших курс лучевой терапии. Индукция TIMP1 приводила к подавлению процессов ремоделирования внеклеточного матрикса и развитию фиброза в ложе трансплантата [46], что является достаточно частым осложнением лучевой терапии [47]. С учётом этих данных можно предположить, что повышение TIMP1 в 3D-модели плоскоклеточного рака характеризует её как более релевантную.

В облучённой 2D-культуре согласованно повышалась экспрессия генов TP63 и CD44, являющихся негативными прогностическими маркёрами (о чём мы писали выше), тогда как в 3D-модели уровень экспрессии этих генов практически не менялся после воздействия нейтронов. Как и в случае с KRT10, данные об изменении экспрессии генов TP63 и CD44 в опухолевых клетках под действием корпускулярного ионизирующего излучения в научной литературе отсутствуют.

Наконец, разнонаправленное изменение уровня экспрессии гена виментина после облучения моделей требует отдельного обсуждения. В близком по дизайну эксперименте при гамма-облучении в дозе 10 Гр двух монослойных линий плоскоклеточного рака наблюдали кратное повышение экспрессии гена VIM и продукции кодируемого им белка. Это повышение регистрировалось уже через 24 часа после воздействия и сохранялось в течение как минимум 8 суток, что говорит о стабильной перестройке цитоскелета облучённых опухолевых клеток [48]. В другом исследовании гамма-облучение в дозе 2 Гр также приводило к повышению продукции виментина в двух монослойных линиях рака груди через 5 суток после воздействия [49]. Напротив, облучение клеток меланомы, культивируемых в виде сфероидов или в составе ксенографта (in vivo модели), напротив, приводило к подавлению продукции виментина [50]. В настоящее время не опубликованы данные об изменении уровня экспрессии VIM или продукции виментина в опухолях головы и шеи после облучения.

Ограничения исследования

К ограничениям исследования следует отнести использование однократной дозы в 10 Гр вместо более релевантного режима из 5 фракций по 2 Гр, который применяется в клинической практике. Вместе с тем такой режим облучения опухолевых моделей был невозможен в силу высокой загруженности генератора нейтронов и строгой ограниченности окна для проведения экспериментальных исследований.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, переход от 2D- к 3D-модели плоскоклеточного рака носовой перегородки приводил к разнонаправленным изменениям экспрессии опухоль-ассоциированных генов: снижению генов кератинов 10 и 17, влияющих на устойчивость опухолевых клеток к терапии, и одновременному повышению генов CDH1, VIM, TGFB1, MMP2, TIMP2, TP63, CD44, PIK3CA, обеспечивающих прогрессирование, метастазирование и лекарственную устойчивость плоскоклеточного рака головы и шеи. Однократное облучение нейтронами 2D- и 3D-моделей также обладало неоднородным эффектом: в монослойной культуре в большей степени возрастала экспрессия генов TP63, CD44, VIM, ассоциированных исключительно с неблагоприятным исходом заболевания, в то время как в 3D-модели сильнее повышалась экспрессия генов CDKN2A, TIMP1 и KRT10, а уровень VIM был подавлен, что свидетельствует о более сложном радиоиндуцированном ответе, включающем остановку клеточного цикла для репарации ДНК, развитие фиброза и пока малоизученные изменения свойств опухолевых клеток, вызванные специфической перестройкой цитоскелета.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Вклад авторов. Соболева А.Г. — определение концепции, проведение исследования, анализ данных, написание черновика рукописи; Арутюнян И.В. — анализ данных, валидация, написание черновика рукописи; Бальчир Д.В. — проведение исследования; Сабуров В.О. — проведение исследования, написание черновика рукописи; Лосицкий Г.А. — проведение исследования; Александрова С.А. — проведение исследования; Макаров А.В. — определение концепции, пересмотр и редактирование текста рукописи; Ельчанинов А.В. — определение концепции, пересмотр и редактирование текста рукописи, руководство проектом. Все авторы одобрили финальную версию перед публикацией, а также согласились нести ответственность за все аспекты работы, гарантируя надлежащее рассмотрение и решение вопросов, связанных с точностью и добросовестностью любой её части.

Этическая экспертиза. Настоящее исследование не предполагает участие людей, использование биоматериалов человека (биологических жидкостей и тканей) или лабораторных животных и не требует прохождения экспертизы в ЛЭК в соответствии с Положением о ЛЭК РНЦХ от 13.11.2020 г.

Источник финансирования. Исследование выполнено при финансовой поддержке гранта РНФ № 24-45-00031.

Раскрытие интересов. Авторы заявляют об отсутствии отношений, деятельности и интересов за последние три года, связанных с третьими лицами (коммерческими и некоммерческими), интересы которых могут быть затронуты содержанием статьи.

Оригинальность. При проведении исследования и создании настоящей работы авторы не использовали ранее опубликованные сведения (текст, иллюстрации, данные).

Доступ к данным. Редакционная политика в отношении совместного использования данных к настоящей работе не применима.

Генеративный искусственный интеллект. При создании настоящей статьи технологии генеративного искусственного интеллекта не использовались.

Рассмотрение и рецензирование. Рукопись направлена в редакцию в инициативном порядке и рассмотрена по обычной процедуре. В рецензировании участвовали два внешних рецензента, член редакционной коллегии и научный редактор издания.

ADDITIONAL INFORMATION

Author contributions: A.G. Soboleva: conceptualization, investigation, formal analysis, writing—original draft; I.V. Arutyunyan: formal analysis, validation, writing—original draft; D.V. Balchir: investigation; V.O. Saburov: investigation, writing—original draft; G.A. Lositskii: investigation; S.A. Aleksandrova: investigation; A.V. Makarov: conceptualization, writing—review & editing; A.V. Elchaninov: conceptualization, supervision, writing—review & editing. All the authors approved the version of the manuscript to be published and agreed to be accountable for all aspects of the work, ensuring that questions related to the accuracy or integrity of any part of the work are appropriately investigated and resolved.

Ethics approval: This study does not involve human subjects, human biomaterials (body fluids and tissues), or laboratory animals. Therefore, the study protocol was not reviewed by the Local Ethics Committee (LEC) according to Regulation on LEC of the B.V. Petrovsky Russian Research Center of Surgery of November 13, 2020.

Funding sources: The work was supported by the Russian Science Foundation grant No. 24-45-00031.

Disclosure of interests: The authors have no relationships, activities or interests for the last three years related with for-profit or not-for-profit third parties whose interests may be affected by the content of the article.

Statement of originality: In creating this work, the authors did not use previously published information (text, illustrations, data).

Data availability statement: The editorial policy regarding data sharing does not apply to this work, and no new data was collected or created.

Generative AI: Generative AI technologies were not used for this article creation.

Provenance and peer-review: This paper was submitted to the journal on an unsolicited basis and reviewed according to the usual procedure. Two external reviewers, a member of the editorial board, and the scientific editor of the publication participated in the review.

About the authors

Anna G. Soboleva

Petrovsky National Research Centre of Surgery; RUDN University

Email: annasobo@mail.ru
ORCID iD: 0000-0002-9158-1933
SPIN-code: 2582-5511

Cand. Sci. (Biology)

Russian Federation, Moscow; Moscow

Irina V. Arutyunyan

Petrovsky National Research Centre of Surgery; RUDN University

Author for correspondence.
Email: labrosta@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0002-4344-8943
SPIN-code: 5220-1893

Cand. Sci. (Biology)

Russian Federation, Moscow; Moscow

Dorzhu V. Balchir

RUDN University

Email: dbalchir@mail.ru
SPIN-code: 2264-5333
Russian Federation, Moscow

Vyacheslav O. Saburov

National Medical Research Radiological Centre

Email: vosaburov@gmail.com
ORCID iD: 0000-0002-6907-2753
SPIN-code: 7212-1328
Russian Federation, Obninsk

George A. Lositskii

Petrovsky National Research Centre of Surgery; RUDN University

Email: glosierror404@gmail.com
ORCID iD: 0009-0001-8822-8645
Russian Federation, Moscow; Moscow

Sofia A. Aleksandrova

Petrovsky National Research Centre of Surgery; RUDN University

Email: sofia.aleksa@mail.ru
Russian Federation, Moscow; Moscow

Andrey V. Makarov

RUDN University

Email: anvitmak@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-2133-2293
SPIN-code: 3534-3764

MD, Cand. Sci. (Medicine)

Russian Federation, Moscow

Andrey V. Elchaninov

Petrovsky National Research Centre of Surgery; RUDN University; National Medical Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology named after Academician V.I. Kulakov

Email: elchandrey@yandex.ru

MD, Dr. Sci. (Medicine), Assistant Professor

Russian Federation, Moscow; Moscow; Moscow

References

Supplementary files