In vitro antiproliferative activity and in vivo antitumor effect of 2,21-bis-[2-pyridinyl]methylidene hollongdione Dp-41 (2NK), a novel hollongdione derivative

Full Text

ОБОСНОВАНИЕ

Злокачественные новообразования остаются одной из ведущих причин смертности населения во всём мире, что стимулирует непрерывный поиск новых высокоэффективных и малотоксичных противоопухолевых препаратов [1–3].

В последние десятилетия особое внимание исследователей уделяется природным соединениям и их полусинтетическим производным как неиссякаемому источнику структурно разнообразных соединений с различными фармакологическими эффектами [4, 5]. Среди них тритерпеноиды, обширный класс изопреноидов, демонстрируют впечатляющий спектр фармакологических свойств, включая выраженную противоопухолевую активность [6].

Особый интерес в рамках данного класса представляют даммарановые тритерпеноиды, характерные для растений семейств Araliaceae и Dipterocarpaceae [7]. Их структурной особенностью является циклический углеродный скелет даммарана, который служит перспективной основой для химической модификации с целью получения новых биологически активных соединений [8, 9]. Холлонгдион — природный даммарановый тритерпенoид, производное диптерокарпола, выделенного из ряда ценных лекарственных растений рода Dipterocarpus, сам по себе проявляет умеренную цитотоксическую активность [10–12]. Однако введение дополнительных функциональных групп в его молекулу позволяет целенаправленно менять его физико-химические и биологические свойства, потенциально усиливая его эффективность и селективность по отношению к опухолевым клеткам [10].

Ранее выявлено значительное антипролиферативное действие синтезированного в одну стадию арилиденового производного холлонгдиона — 2,21-бис-[3-пиридинил]метилиденохоллонгдиона в отношении целого ряда раковых клеток, причём наибольшая активность — 0,8 µМ — наблюдалась в отношении клеточных линий меланомы и рака молочной железы MCF-7. Механизмы, участвующие в антипролиферативной активности указанного соединения, были исследованы с помощью тестов in vitro и ex vivo и продемонстрировали его проапоптотическую и антиангиогенную активность, сопровождающуюся ингибированием митохондриального дыхания [13, 14].

Синтезированный прототип лекарственного средства — арилиденовое производное тритерпеноида даммаранового ряда, а конкретно — холлонгдиона, синтезированного в одну стадию, согласно работе [15], на основе диптерокарпола — основного метаболита живицы Dipterocarpus alatus [16]. Новое производное идентифицировано как соединение со значительной цитотоксичностью в сравнении с цитотоксичностью исходного диптерокарпола.

Таким образом, разработка новых производных на основе природного каркаса холлонгдиона является актуальной задачей современной медицинской химии. В данном исследовании мы оценили антипролиферативную активность нового арилиденового производного холлонгдиона на панели линий опухолевых клеток человека in vitro и в ксенографтных моделях опухолей человека in vivo.

ЦЕЛЬ

Изучение цитотоксической и противоопухолевой активности нового арилиденового производного холлонгдиона — 2,21-бис-[2-пиридинил]метилиденохоллонгдиона.

МЕТОДЫ

Дизайн исследования

В данном исследовании мы изучили влияние нового производного тритерпеновой кислоты Dp-41(2NK) на жизнеспособность нескольких опухолевых линий, представленных ниже, апоптоз, клеточный цикл и архитектуру 3D-сфероидов клеток PANC-1, а также провели эксперименты, в ходе которых оценили эмбриотоксичность и последующую противоопухолевую активность на эмбрионах Danio rerio. Жизнеспособность оценивали с помощью MTT-теста, апоптоз — методом проточной цитометрии с аннексином V. Сфероиды обрабатывали различными концентрациями препарата в течение 24, 48 и 72 часов. Морфологические изменения эмбрионов изучали с помощью конфокальной микроскопии. Результаты продемонстрировали дозо- и времязависимое снижение жизнеспособности и увеличение апоптоза, что коррелировало с дезинтеграцией структуры сфероидов. При работе с оптимальными дозами препарата на эмбрионах было выявлено уменьшение объёма опухоли.

Условия проведения и продолжительность исследования

Новое производное было синтезировано в научно-исследовательской группе медицинской химии Уфимского института химии Уфимского федерального исследовательского центра Российской академии наук (УФИЦ РАН). Биологическая сторона исследования проводилась в Национальном медицинском исследовательском центре онкологии им. Н.Н. Блохина с апреля 2023 по июль 2025 года.

Dp-41 (2NK)-методика синтеза

В условиях реакции Кляйзена–Шмидта взаимодействием холлонгдиона с 2-пиридинкарбальдегидом в присутствии 40% KOH в этаноле получен 2,21-бис-[2-пиридинил]метилиденохоллонгдион, согласно методике, описанной в работе [10]. Данный образец (рис. 1) был синтезирован в научно-исследовательской группе медицинской химии Уфимского института химии УФИЦ РАН.

 

Рис. 1. Химическая формула используемого в исследовании соединения 2,21-бис-[2-пиридинил]метилиденохоллонгдиона.

Fig. 1. The chemical formula of the 2,21-bis-[2-pyridinyl]methylidenochollongedione.

 

Данные ЯМР-спектроскопии с применением спектрометра Bruker 500 и 125.5 МГц: ¹H NMR (СDCl3, δ ppm, J Hz): 0.82 (s, 3H, H-19); 0.98 (s, 3H, H-30); 1.06 (s, 3H, H-18); 1.14 (s, 3H, H-28); 1.19 (s, 3H, H-29); 1.27 (m, 1H, Hα-15); 1.32 (m, 1H, Hax-11); 1.34 (m, 1H, Hax-12); 1.38 (m, 1H, Heq-7); 1.49 (m, 1H, Heq-6); 1.56 (m, 1H, H-5); 1.57 (dd, 1H, 3J9-11ax=11.8, 3J9-11eq=3.3, H-9); 1.58 (m, 1H, Hax-6); 1.65 (ddd, 1H, 2J=14.2, 3J7ax-6ax=14.7, 3J7ax-6eq=4.7, Hax-7); 1.68 (m, 1H, Heq-11); 1.72 (m, 1H, Heq-12); 1.74 (m, 1H, Hβ-15); 1.88 (dddd, 1H, 2J=13.4, 3J16β-15β=10.7, 3J16β-17=6.5, 3J16β-15α=1.8, Hβ-16); 2.02 (ddt, 1H, 2J=13.4, 3J16α-17=10.8, 3J16α-15α=8.6, 3J16α-15β=8.6, Hα-16); 2.11 (ddd, 1H, 3J13-12ax=12.4, 3J13-17=10.8, 3J13-12eq=3.8, H-13); 2.48 (dd, 1H, 2J=18.0, 4J1α-31=3.6, Hα-1); 3.02 (td, 1H, 3J17-13=10.8, 3J17-16α=10.8, 3J17-16β=6.5, H-17); 3.57 (dd, 1H, 2J=18.0, 4J1β-31=1.8, Hβ-1); 7.17 (ddd, 1H, 3J35-36=7.7, 3J35-34=4.9, 4J35-37=1.2, H-35); 7.22 (d, 1H, 3J21-38=15.8, H-21); 7.28 (ddd, 1H, 3J42-43=7.7, 3J42-41=4.9, 4J42-44=1.2, H-42); 7.36 (dd, 1H, 4J31-1α=3.6, 4J31-1β=1.8, H-31); 7.38 (dd, 1H, 3J37-36=7.7, 4J37-35=1.2, H-37); 7.48 (dd, 1H, 3J43-44=7.7, 4J44-42=1.2, H-44); 7.55 (d, 1H, 3J38-21=15.8, H-38); 7.68 (dt, 1H, 3J36-35=7.7, 3J36-37=7.7, 4J36-34=2.0, H-36); 7.73 (td, 1H, 3J43-44=7.7, 3J43-42=7.7, 4J43-41=2.0, H-43); 8.67 (dd, 1H, 3J41-42=4.9, 4J41-43=2.0, H-41); 8.69 (dd, 1H, 3J34-35=4.9, 4J34-36=2.0, H-34). 13C NMR (СDCl3, δ ppm): 14.99 (C18); 15.86 (C30); 16.04 (C19); 20.42 (C6); 22.07 (C11); 22.33 (C29); 25.81 (C12); 26.34 (C16); 29.48 (C28); 31.79 (C15); 34.59 (C7); 36.28 (C10); 40.40 (C8); 45.29 (C1); 45.46 (C4); 46.07 (C13); 48.50 (C9); 50.35 (C14); 52.17 (C17); 53.37 (C5); 122.26 (C35); 124.28 (C42); 124.57 (C44); 126.85 (C37); 129.94 (C21); 134.20 (C31); 136.15 (C36); 136.88 (C43); 138.72 (C2); 140.78 (C38); 149.52 (C34); 150.18 (C41); 153.46 (C39); 155.65 (C32); 203.83 (C20); 208.95 (C3).

Культуры клеток

В работе были использованы культуры клеток человека: рак молочной железы (MCF7, MDA-MB-231, SKBR3, T-47D), рак предстательной железы человека (22Rv1, PC-3, DU-145), глиобластома человека (U-87MG, U-251MG), рак печени (Huh7, HepG2), рак поджелудочной железы (MIAPaCa-2, PANC-1), рак лёгкого (A549), рак яичников (SK-OV-3), меланома человека (Меl-P, SK-MEL-28), рак толстой кишки (SW620, HCT 116, HT-29,Colo-205), фибросаркома (НТ-1080), полученные из ресурсов биоколлекции Федерального государственного бюджетного учреждения «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии имени Н.Н. Блохина» Министерства здравоохранения Российской Федерации. Клетки культивировали в питательной среде RPMI-1640 с добавлением 10% телячьей эмбриональной сыворотки (Gibco, Thermo Fisher Scientific, США) и 1% раствора пенициллина / стрептомицина («ПанЭко», Россия) в среде 5% CO₂ при температуре 37 °C. Выбранные клеточные модели и методики оценки цитотоксичности были нами ранее охарактеризованы в исследованиях соединений различного механизма действия [13, 17].

Оценка цитотоксической активности на 2D-культуре клеток

Цитотоксичность оценивали с помощью МТТ-теста на культурах клеток, инкубированных с исследуемыми соединениями в указанных концентрациях до 100 мг/мл в течение 72 ч. Оценивали жизнеспособность клеток (процент от контроля) в зависимости от концентрации соединений. Рассчитывали IC₅₀ (концентрацию лекарственного средства, которая ингибировала рост клеток на 50%). Все эксперименты проводили в трёх повторах.

Сфероиды из линии клеток рака поджелудочной железы PANC-1

Сфероиды были получены с помощью специальных молдов 9×9, которые были изготовлены методом 3D-печати из геля, содержащего 2% агарозы («ПанЭко», Россия). Для получения сфероидов готовили суспензию клеток в полной питательной среде в концентрации 1,4×10⁶ клеток/мл (PANC-1), и по 150 мкл этой суспензии добавляли в каждую форму. В каждый подготовленный молд добавляли по 150 мкл готовой суспензии клеток. Для формирования сфероидов 6-луночные планшеты с молдами инкубировали при 37 °C и 5% CO₂ в течение 24 часов.

К сформировавшимся сфероидам добавляли препараты в концентрациях IC₅₀ и инкубировали в течение 72 ч. После окончания инкубации проводили оценку жизнеспособности клеток с помощью МТТ-теста. Жизнеспособность рассчитывали как процентное соотношение сигналов сфероидов, инкубированных в присутствии и в отсутствие изученного соединения:

$\frac{F_t-F_{min}}{F_{max}-F_{min}}\times 100\%$, (1)

где F_t — сигнал флуоресценции для тестируемой концентрации исследуемого препарата; F_min — минимальный сигнал флуоресценции, соответствующий сигналу для сфероидов, не обработанных исследуемым соединением; F_max — максимальный сигнал флуоресценции, соответствующий сигналу для сфероидов, обработанных лизирующим буфером, вызывающим 100% гибель сфероидов.

Анализ клеточного цикла

В опыте использовали культуры клеток с различной чувствительностью к изучаемому соединению (HT29, SW620 и U-87 MG). Их высевали по 3×10⁵ клеток в лунки 6-луночных планшетов и инкубировали с Dp-41 (2NK) при IC₅₀ в течение 24 ч (для U-87 MG использовали концентрацию 100 µМ).

После обработки клетки окрашивали йодистым пропидием и анализировали на автоматическом флуоресцентном анализаторе ADAMII™ LS (NanoEntek, Корея).

Определение апоптоза

Апоптоз оценивали в тех же условиях, в которых выполняли анализ клеточного цикла, с использованием набора ADAMII™ LS Apoptosis Detection Kit (NanoEntek, Корея). Клетки после инкубации окрашивали аннексином V и 4′,6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI) и анализировали на ADAMII™ LS; данные обрабатывали с помощью программного обеспечения производителя.

Животные

Эмбрионы рыб Danio rerio AB получали от рыб собственного разведения лаборатории биохимических основ фармакологии и опухолевых моделей ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России. Взрослых рыб дикого типа Danio rerio AB содержали в аквариумах с системой аэрации и рециркуляции воды при температуре 28 °C, pH 6,5–7,5 и световом дне 14 часов света / 10 часов темноты. Рыб кормили два раза в сутки в соответствии со стандартными рекомендациями по кормлению Danio rerio [18]. Для нереста использовали половозрелых рыб в возрасте трёх месяцев. Эмбрионы были собраны и помещены в среду для эмбрионов Danio rerio E3 (5 мМ NaCl, 0,33 мМ MgSO₄×7H₂O, 0,33 мМ CaCl₂, 0,17 мМ KCl, 0,1% метиленового синего).

Неоплодотворённые яйцеклетки и эмбрионы, у которых через 24 часа после оплодотворения были обнаружены значительные дефекты развития, были выявлены с помощью светового микроскопа Nexcope NSZ-810 и исключены из эксперимента (10 эмбрионов).

Оценка токсичности на эмбрионах Danio rerio

Экспериментальные эмбрионы в количестве 20 были разделены на 4 группы по 5 эмбрионов в каждой. Их механически дехорионизировали пинцетом и помещали в 24-луночные планшеты по 2 эмбриона в лунку в объёме воды Е3 1,5 мл в лунку, которая содержала 1,5, 3 и 6 µМ Dp-41 (2NK). Оценивали токсичность исследуемого агента на эмбрионах рыб в течение 144 ч инкубации. Для описания результатов использовали следующие параметры: нарушение и задержка развития, морфологические изменения, включая отёчность формы желточного мешочка, нарушение развития хвоста и снижение двигательной активности. Летальную концентрацию 50% (LD₅₀) рассчитывали по значениям суммарной смертности эмбрионов в группах с использованием программного обеспечения Graphpad Prism версии 9.1.

Оценка противоопухолевого эффекта на эмбрионах Danio rerio

Клетки линии рака толстой кишки HCT-116 были предварительно помечены флуоресцентным красителем CFSE (Lumiprobe) для последующей инъекции. Для мечения клетки инкубировали в течение 20 мин при 37 °C и проводили двукратную отмывку раствором PBS (согласно рекомендациям производителя). С помощью микроинжекторной установки (RWD Life Science микронасос R-480 и микроманипулятор MP-550) вводили по 15 нл клеточной суспензии (примерно 200 живых клеток на эмбрион) в желточный мешочек. После инъекции клеток (в течение двух часов) эмбрионы переносили в 24-луночный планшет (1 эмбрион на лунку). Испытуемый препарат растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО) и доводили до нужной концентрации (выбранной в предшествующем тесте на токсичность) в воде для эмбрионов, при этом конечная концентрация ДМСО была ниже 0,1%, и добавляли в воду.

Эмбрионы с введёнными клетками содержали при 32 °C для оптимального роста клеток млекопитающих. Через 24 ч после инъекции проводили отбор эмбрионов с опухолями и рандомизировали на две группы: контрольную и опытную. В воду эмбрионам опытной группы добавляли изучаемый Dp-41 (2NK). Через 24 и 72 часа после добавления препарата в воду проводили визуализацию опухолевых клеток в желточном мешочке эмбриона с последующей оценкой площади опухоли под стереоскопическим флуоресцентным микроскопом. Фотографии эмбрионов с опухолями были обработаны с использованием программного обеспечения ImageJ: изображение раскладывали по зелёному каналу и по градиенту серого определяли и отмечали опухолевые области с дальнейшим расчётом площади по размерам выделенной области опухоли.

Этическая экспертиза

Все эксперименты на эмбрионах рыб Danio rerio были проведены в соответствии с руководящими принципами Европейской директивы 2010/63/EС по защите животных, используемых в научных целях, и ARRIVE. Протокол исследования был одобрен Этическим комитетом НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина (номер протокола 03m-2024 от 23.04.2024).

Статистическая обработка

Значения МТТ-теста представлены в виде «среднее ± стандартное отклонение» (M±SD). Обработку результатов МТТ-тестов проводили по трём повторам методом нелинейной регрессии. Модель регрессии представляла собой зависимость ингибирования роста клеток рака предстательной железы от концентрации используемых агентов. Полученные значения представлены в виде M±SD. Для анализа было использовано программное обеспечение Graphpad Prism version 4.0 for Windows (GraphPad Software, США). Данные опытов по оценке противоопухолевого эффекта были проанализированы методами описательной статистики. Сравнение с контрольной группой проводили с использованием непараметрического критерия Манна–Уитни. Значения представлены в виде «среднее ± стандартная ошибка» (M±SE). Для анализа использована программная среда SPSS Statistics V. 22.0 (IBM, США). Уровень значимости для всех видов анализа был установлен равным 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Оценка цитотоксической активности на 2D-культуре клеток

Наиболее высокую цитотоксическую активность Dp-41 (2NK) продемонстрировал на культурах клеток DU145 — 0,65±0,033 µМ, HCT116 — 0,99±0,01 µМ, PANC-1 — 0,22±0,034 µМ и А549 — 0,58±0,04 µМ (табл. 1).

 

Таблица 1. Значения IC₅₀, рассчитанные на основании МТТ-теста при оценке цитотоксичности Dp-41 (2NK)

Table 1. IC₅₀ values calculated on the basis of the MTT test for assessing the cytotoxicity of Dp-41 (2NK)

Культура клеток	IC50, M±SE, µМ
Mel P	4,1±0,09
SKOV3	6,4±0,08
SKBR3	3,3±0,08
HCT116	0,99±0,01
DU145	0,7±0,03
PC3	4,2±0,01
PANC-1	0,2±0,03
SK-MEL-28	3,1±0,09
T-47D	3,7±0,09
HT29	11,8±0,04
A549	0,6±0,04
MCF-7	>100*
22RV1	21,8±0,06
HepG-2	19,9 ±0,06
HT-1080	>100*
Colo 205	2,9±0,24
U-251 MG	18,2±0,07
Huh-7	63,4±0,08
MIA Paca-2	47,99±0,10
U-87 MG	>100*
SW620	1,1±0,09

Примечание. * По отношению к культурам клеток MCF-7, HT-1080 и U-87 MG при значениях IC₅₀ >100 µМ препарат был неактивен.

 

Оценка цитотоксической активности на 3D-культуре клеток

Сфероиды были сформированы из опухолевых клеток поджелудочной железы PANC-1. Dp-41 (2NK) в концентрации, равной IC₅₀, вызывает гибель клеток и нарушает формирование сфероидов. В концентрации 6 µМ данное соединение показало наибольшую активность. Процентное соотношение живых клеток не превышало 20% (рис. 2).

 

Рис. 2. Микрофотографии сфероидов из клеток рака поджелудочной железы PANC-1 после инкубации с соединением Dp-41 (2NK), фазово-контрастная микроскопия: a — 6 μM, b — 3 μM, c — 1,5 μM, d — контроль.

Fig. 2. Micrographs of spheroids from pancreatic cancer PANC1 cells after incubation with Dp-41 (2NK) compound, phase contrast microscopy: a — 6 μM, b — 3 μM, c — 1.5 μM, d — контроль.

 

Анализ клеточного цикла и оценка активности апоптоза

Влияние Dp-41 (2NK) на клеточный цикл оценивали на культурах клеток HT29, SW620 и U-87 MG с установленной различной чувствительностью к соединению (рис. 3, табл. 2).

 

Рис. 3. Распределение клеток по фазам клеточного цикла под действием соединения Dp-41 (2NK) после 24-часовой инкубации (графики получены на проточном цитометре ADAMII™ LS): a — U-87 MG, b — SW620, с — HT29.

Fig. 3. Distribution of cells by cell cycle phases under the action of compound Dp-41 (2NK) after 24-hour incubation (graphs obtained on an ADAMIILS flow cytometer): a — U-87 MG, b — SW620, с — HT29.

 

Таблица 2. Влияние соединения Dp-41 (2NK) на распределение клеток по фазам клеточного цикла

Table 2. Effect of compound Dp-41 (2NK) on cell distribution by cell cycle phases

Фаза	U-87 MG		SW620		HT29
	клеток/мл	M±SE, %	клеток/мл	M±SE, %	клеток/мл	M±SE, %
G0/G1	9,88×104	14,4±0,11	2,83×105	52,24±1,03	3,3×105	36,87±0,61
S	9,71×104	14,2±0,04	1,22×105	23,33±0,42	1,7×105	18,94±0,09
G2/M	2,55×105	37,1±0,38	3,82×104	7,33±0,03	3,2×105	35,74±0,57

 

Показано, что соединение Dp-41 (2NK) оказывает различное влияние на исследованные клеточные линии. В SW620 наблюдалось уменьшение числа клеток в S-фазе при незначительном увеличении доли клеток в G1-фазе, а также значимое снижение (p=0,03) уровня апоптоза по сравнению с контролем (см. рис. 3, b). В клетках HT29, напротив, отмечена остановка в S-фазе с последующим накоплением апоптотических клеток. В совокупности эти результаты указывают, что Dp-41 (2NK) может проявлять как цитостатический, так и антипролиферативный эффект в зависимости от типа клеточной линии. При этом данные, полученные при анализе клеточного цикла, подтвердили отсутствие действия на культуру клеток U-87 MG.

Цитостатическая активность, вероятно, определяется индукцией остановки клеточного цикла в фазе S или G₂/M, тогда как цитотоксичность обоих соединений возникает при запуске апоптоза без существенных изменений в распределении клеточного цикла.

Апоптоз сопровождается изменением структуры плазматической мембраны при увеличении содержания на поверхности клетки фосфатидилсерина, который, в свою очередь, связывается с аннексином V. Следовательно, в качестве маркёра для выявления апоптотической гибели клеток используют аннексин V. Количество нежизнеспособных клеток, которые связываются с аннексином V, позволяет судить о позднем апоптозе.

В данной работе были оценены суммарные количества апоптотических клеток (ранний, поздний апоптоз) и клеток, которые вошли в некроз.

Было обнаружено, что клетки HT29, SW620 и U-87 MG, инкубированные в течение 24 ч с соединением Dp-41 (2NK), демонстрировали умеренное увеличение как ранних, так и поздних апоптотических клеток (табл. 3).

 

Таблица 3. Изменение количества клеток, связывающихся с аннексином V, после 24 ч инкубации с Dp-41 (2NK)

Table 3. Change in the number of cells binding to annexin V after 24 h incubation with Dp-41 (2NK)

Клеточная линия	Жизнеспособная клетка	Ранний апоптоз	Поздний апоптоз	Некроз
U-87 MG, M±SE, %	81,17±3,08	12,20±1,10	4,08±0,03	2,55±0,01
SW620, M±SE, %	73,74±7,31	14,80±0,74	5,69±0,07	5,77±0,08
HT29, M±SE, %	74,19±5,02	12,61±0,49	10,23±0,02	2,96±0,03

 

Таким образом, эти данные указывают и подтверждают, что соединение Dp-41 (2NK) вызывает значительное увеличение апоптоза в клетках HT29, SW620 и U-87 MG (рис. 4).

 

Рис. 4. Репрезентативные изображения окрашенных клеток U-87 MG под действием Dp-41 (2NK) при 24 ч инкубации с аннексином V.

Fig. 4. Representative images of stained U-87 MG cells exposed to Dp-41 (2NK) at 24 h incubation with annexin V.

 

Оценка токсичности Dp-41 (2NK) in vivo на эмбрионах рыб Danio rerio

Токсичность Dp-41 (2NK) in vivo была протестирована на эмбрионах рыб Danio rerio. Признаки острой токсичности наблюдали при добавлении Dp-41 (2NK) в концентрации 6 µМ — она проявлялась повышением двигательной активности и гибелью эмбриона в течение первого часа наблюдения. Когда Dp-41 (2NK) добавляли в концентрации 3 µМ, наблюдалось повышение двигательной активности хвоста, что свидетельствует о раздражающем токсическом действии. Задержку развития и деформацию позвоночника наблюдали при концентрации 3 µМ Dp-41 (2NK) после 24-часовой инкубации (табл. 4, рис. 5). Гибель эмбрионов (100%) наблюдали после 24-часовой инкубации с концентрацией 6 µМ Dp-41 (2NK), тогда как при 3 µМ Dp-41 (2NK) 50% эмбрионов погибли после 48-часовой инкубации. Отмечали развитие деформаций позвоночника, увеличение отёчности желточного мешка и отставание в развитии через 24 часа, на момент 48 часов все эмбрионы погибли (кривые выживаемости Каплана–Майера представлены на рис. 6).

 

Таблица 4. Выживаемость эмбрионов рыб Danio rerio под действием Dp-41 (2NK) при инкубации в течение 5 суток

Table 4. Survival of Danio rerio fish embryos under the action of Dp-41 (2NK) during incubation for 5 days

Время, ч	Концентрация Dp-41 (2NK)
	6 µМ	3 µМ	1,5 µМ	0 µМ
24	0/5	5/5	5/5	5/5
48	0/5	0/5	5/5	5/5
120	0/5	0/5	2/5	5/5

Примечание. Данные представлены как количество погибших эмбрионов / абсолютное число эмбрионов.

 

Рис. 5. Эмбрионы Danio rerio после 120-часовой инкубации с Dp-41 (2NK): контрольная группа и группа, подвергнутая воздействию 1,5 и 3 µМ Dp-41 (2NK).

Fig. 5. Danio rerio embryos after 120-hour incubation with Dp-41 (2NK): the control group and the group exposed to 1.5 and 3 µM Dp-41 (2NK).

 

Рис. 6. Кривые выживаемости Каплана–Майера эмбрионов Danio rerio при инкубации с Dp-41 (2NK).

Fig. 6. Kaplan-Mayer survival curves of Danio rerio embryos incubated with Dp-41 (2NK).

 

Эмбрионы, инкубированные с 1,5 µМ Dp-41 (2NK), не отличались от особей контрольной группы в течение первых суток эксперимента. Однако с 48 часов после начала инкубации у них наблюдалась деформация позвоночника. К 120 часам после начала инкубации 3 из 5 эмбрионов погибли, а оставшиеся 2 не только выжили, но и продолжили развиваться, несмотря на деформацию позвоночника.

Расчётная полулетальная концентрация (LD₅₀) составила 1,4±0,5 µМ (см. рис. 5). Таким образом, токсичность Dp-41 (2NK) зависит от концентрации.

Оценка противоопухолевого эффекта на эмбрионах рыб Danio rerio

Средняя площадь опухоли через 24 часа после имплантации клеток в группе контроля составила 0,031±0,004 мм², в экспериментальной группе — 0,026±0,009 мм² (без статистически значимых различий).

По итогам 48-часовой инкубации с препаратом Dp-41 (2NK) наблюдалось значительное ингибирование роста опухоли при показателе торможения роста опухоли 72%. Индекс прироста в группе эмбрионов, в воду которым добавляли Dp-41 (2NK), составлял 0,5±0,06 (отличие от контроля статистически значимо при p=0,05) в сравнении с контрольной группой, где отмечался индекс прироста 1,4±0,17 (табл. 5, рис. 7), при средней площади опухоли 0,012±0,007 мм² (p=0,025) в опытной группе и 0,043±0,001 мм² — в контрольной. На рис. 8 представлены фотографии эмбрионов контрольной и опытной групп.

 

Таблица 5. Результат сравнения индекса прироста опухоли в контрольной группе и при применении нового производного

Table 5. The result of comparing the tumor growth index in the control and with the use of a new derivative

Группа	24 hpi	72 hpi	Индекс прироста опухоли
Контроль, M±SE	0,031±0,004	0,043±0,001	1,4±0,17
Dp-41 (2NK), M±SE	0,026±0,009 (p=0,655)	0,012±0,007 (p=0,025)	0,5±0,06 (p=0,05)

Примечание. hpi — hours post-insemination / часы после оплодотворения.

 

Рис. 7. Динамика роста опухолей HCT-116 у эмбрионов Danio rerio, в воду которым добавляли Dp-41 (2NK) в концентрации 1,5 µМ, и без добавления (контроль) в течение 48-часовой инкубации.

Fig. 7. Dynamics of HCT-116 tumor growth in Danio rerio embryos to which Dp-41 (2NK) was added at a concentration of 1.5 µM and without addition (control) during 48-hour incubation.

 

Рис. 8. Эмбрионы Danio rerio с опухолями до добавления препарата и через 48 часов после инкубации с Dp-41 (2NK): a–f — контрольная группа, g–l — группа, подвергнутая воздействию 1,5 µМ Dp-41 (2NK). Фото были обработаны с помощью программного обеспечения ImageJ: опухоли выделены красным цветом. hpi — hours post-insemination / часы после оплодотворения.

Fig. 8. Danio rerio embryos with tumors before the addition of the drug and 48 hours after incubation with Dp-41 (2NK): a–f — the control group, g–l — the group exposed to 1.5 µM Dp-41 (2NK). The photos were processed in ImageJ software: tumors are highlighted in red. hpi — hours post-insemination.

 

ОБСУЖДЕНИЕ

Представленные результаты демонстрируют, что новое производное холлонгдиона Dp-41 (2NK) обладает выраженной антипролиферативной активностью в отношении панели линий опухолевых клеток, в частности рака предстательной железы DU145 (IC₅₀=0,7±0,03 µМ), рака толстой кишки HCT116 (IC₅₀=0,99±0,01 µМ), рака поджелудочной железы PANC-1 (IC₅₀=0,2±0,03 µМ) и аденокарциномы лёгкого А549 (IC₅₀=0,6±0,04 µМ). Полученные данные соотносятся с контекстом современных исследований в области производных природных соединений и целеориентированного дизайна противоопухолевых препаратов, как это освещено в последних литературных источниках [10–12, 19].

Это подтверждает, что молекулярный каркас холлонгдиона является высокоперспективной основой для разработки новых противоопухолевых агентов. Наше исследование развивает данную концепцию, демонстрируя, что направленная модификация исходной структуры позволяет существенно усилить её биологическую активность [20].

Данные анализа клеточного цикла (блокировка в фазе G1/S — классическая для многих тритерпеноидов) могут свидетельствовать о том, что происходит индукция апоптоза по пути PI3K/Akt/mTOR [21], что было описано ранее для тритерпеноидов с аналогичными структурами [22]. Мы предполагаем, что новое производное реализует свой эффект через аналогичный механизм, что объясняет его высокую эффективность.

Одно из тритерпеновых производных, выделенное из дикой горькой тыквы (Momordica charantia L.), активирует рецептор, запускаемый пероксисомами (PPARg), и впоследствии модулирует множественные сигнальные пути, нацеленные на PPARg, с участием многочисленных эффекторов, таких как циклин D1, CDK6, Bcl-2, XIAP, циклооксигеназа-2, NF-KB, ERa, AKT и AMPK, что в конечном итоге приводит к апоптозу [19]. Хотя в нашем исследовании не рассматривались детали этого взаимодействия, выявленная активность открывает новое направление для дальнейших исследований, является ли антипролиферативный эффект исключительно следствием дестабилизации микротрубочек или же он дополняется изменением активности сигнальных путей.

Ограничения исследования

Ключевое ограничение данного исследования связано с работой на рыбах Danio rerio. Модель эмбрионов Danio rerio не является полным аналогом человеческого заболевания. Физиология, метаболизм и ответ на лечение могут существенно отличаться, потому мы можем лишь предполагать аналогичное отсутствие побочных эффектов в оптимальной дозировке препарата.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, новое синтезированное производное холлонгдиона Dp-41 (2NK) проявляет выраженную антипролиферативную активность in vitro. Данное исследование подтверждает рациональность стратегии модификации природных даммарановых тритерпеноидов для создания новых противоопухолевых препаратов. Перспективы дальнейшей работы включают оценку эффективности in vivo, более детальное изучение молекулярного механизма путей апоптоза и исследование влияния на специфические сигнальные пути с целью уточнения механизма действия.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Вклад авторов. Михеенко А.М. — написание черновика рукописи, проведение исследования, визуализация; Смирнова И.Е. — проведение исследования, работа с данными, анализ данных; Бихаймал Х. — написание черновика рукописи, проведение исследования; Бабаева Г. — работа с данными, анализ данных, проведение исследования; Хан И.И. — работа с данными, анализ данных, проведение исследования, валидация; Казакова О.Б. — пересмотр и редактирование рукописи, научное редактирование статьи; Покровский В.С. — пересмотр и редактирование рукописи, научное редактирование статьи, привлечение финансирования, администрирование проекта, валидация. Все авторы одобрили рукопись (версию для публикации), а также согласились нести ответственность за все аспекты работы, гарантируя надлежащее рассмотрение и решение вопросов, связанных с точностью и добросовестностью любой её части.

Этическая экспертиза. Протокол исследования был одобрен Этическим комитетом НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина (номер протокола 03m-2024 от 23.04.2024).

Источники финансирования. Работа выполнена при финансовой поддержке в рамках государственного задания Министерства науки и высшего образования РФ № 075-01551-23-00 (FSSF-2023-0006) «Поиск эффективных и безопасных фармакологических пар на основе низкомолекулярных соединений и ферментов с противоопухолевой активностью» (рег. номер 1022040600928-8-1.6.4;1.6.5;3.1.5;3.1.6 от 2022 г.). Синтез изучаемых агентов осуществлён в рамках Программы фундаментальных научных исследований в Российской Федерации на долгосрочный период (2021–2030 годы) (№ 122030100170-5).

Раскрытие интересов. Авторы заявляют об отсутствии отношений, деятельности и интересов за последние три года, связанных с третьими лицами (коммерческими и некоммерческими), интересы которых могут быть затронуты содержанием статьи.

Оригинальность. При создании настоящей работы авторы не использовали ранее опубликованные сведения (текст, иллюстрации, данные).

Доступ к данным. Все данные, полученные в настоящем исследовании, доступны в статье.

Генеративный искусственный интеллект. При создании настоящей статьи технологии генеративного искусственного интеллекта не использовали.

Рассмотрение и рецензирование. Настоящая работа подана в журнал в инициативном порядке и рассмотрена по обычной процедуре. В рецензировании участвовали два внешних рецензента, член редакционной коллегии и научный редактор издания.

ADDITIONAL INFORMATION

Author contributions: A.M. Mikheenko: writing—original draft, investigation, visualization; I.E. Smirnova: investigation, data curation, formal analysis; J. Beejaimal: writing—original draft, investigation; G. Babaeva: data curation, formal analysis, investigation; I.I. Khan: data curation, formal analysis, investigation, validation; O.B. Kazakova: writing—review & editing, supervision; V.S. Pokrovsky: writing—review & editing, supervision, funding acquisition, project administration, validation. All the authors approved the version of the manuscript to be published and agreed to be accountable for all aspects of the work, ensuring that questions related to the accuracy or integrity of any part of the work are appropriately investigated and resolved.

Ethics approval: The study protocol was approved by the Local Ethics Committee of the Blokhin National Medical Research Center of Oncology (Minutes No. 03m-2024 dated April 23, 2024).

Funding source: This work was supported by the Ministry of Science and Higher Education of the Russian Federation No. 075-01551-23-00 (FSSF-2023-0006) “Search for effective and safe pharmacological pairs based on low molecular weight compounds and enzymes with antitumor activity” (reg. number 1022040600928-8-1.6.4;1.6.5;3.1.5;3.1.6 from 2022). Synthesis of the studied agents was carried out within the framework of the Program of Fundamental scientific research in the Russian Federation for the long-term period (2021–2030) (No. 122030100170-5).

Disclosure of interests: The authors have no relationships, activities, or interests for the last three years related to for-profit or not-for-profit third parties whose interests may be affected by the content of the article.

Statement of originality: No previously published materials (text, images, or data) were used in this work.

Data availability statement: All data generated during this study are available in this article.

Generative AI: No generative artificial intelligence technologies were used to prepare this article.

Provenance and peer review: This paper was submitted unsolicited and reviewed following the standard procedure. The peer review process involved two external reviewers, a member of the editorial board, and the in-house scientific editor.

About the authors

Anastasia M. Mikheenko

Blokhin National Medical Research Center of Oncology; RUDN University

Email: amiheenko7@gmail.com
ORCID iD: 0009-0009-2158-3915
Russian Federation, Moscow; Moscow

Irina E. Smirnova

Ufa Federal Research Centre of the Russian Academy of Science

Email: si8081@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0001-7176-505X

Cand. Sci. (Chemistry)

Russian Federation, Ufa

Gulyalek A. Babayeva

Blokhin National Medical Research Center of Oncology; RUDN University

Email: babaevagulyalek@gmail.com
ORCID iD: 0000-0001-5781-7925
SPIN-code: 8547-6770

Cand. Sci. (Biology)

Russian Federation, Moscow; Moscow

Jaunita Beejaimal

RUDN University

Email: jay.beejaimal4@gmail.com
Russian Federation, Moscow

Irina I. Khan

Blokhin National Medical Research Center of Oncology; RUDN University

Email: irinchek05@gmail.com
ORCID iD: 0000-0003-2948-0872
SPIN-code: 6826-7694

Cand. Sci. (Biology)

Russian Federation, Moscow; Moscow

Oksana B. Kazakova

Ufa Federal Research Centre of the Russian Academy of Science

Email: obf@anrb.ru
ORCID iD: 0000-0002-5606-1588

Dr. Sci. (Chemistry), Professor

Russian Federation, Ufa

Vadim S. Pokrovsky

Blokhin National Medical Research Center of Oncology; RUDN University

Author for correspondence.
Email: pokrovskiy-vs@rudn.ru
ORCID iD: 0000-0003-4006-9320
SPIN-code: 4552-1226

MD, Dr. Sci. (Medicine), Professor

Russian Federation, Moscow; Moscow

References

Supplementary files