Obtaining and characterizing rhodamine B immunoconjugates

Full Text

ОБОСНОВАНИЕ

Моноклональные антитела (МКАТ) являются современным инструментом для высокоспецифического распознавания антигенов. В аспекте онкологических заболеваний оправдала себя идея использования МКАТ в качестве высокоселективных терапевтических средств, которые усиливают противоопухолевый иммунный ответ [1]. В 2021 г. Управление по контролю качества пищевых продуктов и лекарственных средств (Food and Drug Administration, FDA) зарегистрировало 41 антитело для лечения рака, а в клинических исследованиях на этот момент находилось еще 106 антител данной направленности¹². С ещё большей эффективностью проявили себя конъюгаты МКАТ с лекарственными средствами — иммуноконъюгаты. Чаще всего в качестве лекарственных средств используются цитостатики, а связанные с ними антитела имеют сродство к опухолевым поверхностным маркёрам. Введение иммуноконъюгатов в кровоток позволяет целевым образом доставлять препарат к опухолевым клеткам, сводя к минимуму системную токсичность связанного с ним препарата [2–4]. Создание модифицированных антител, пригодных для роли терапевтических иммуноконъюгатов, представляет особую задачу, поскольку, подвергая антитело химическому воздействию «в пробирке», необходимо не нарушить его функциональные, в первую очередь антигенраспознающие, свойства. Более того, полученный иммуноконъюгат должен включать достаточное количество молекул лекарства — целевых молекул (ЦМ) — для проявления необходимого терапевтического воздействия.

Молекулы IgG, основная часть МКАТ, используемых в терапии, представляют собой гликопротеиды. Они имеют осевую симметрию, полипептидные цепи на уровне 3D-структуры уложены в домены. В состав молекулы IgG входят четыре полипептидные цепи — две тяжёлые (H-цепи), состоящие из 4 доменов, и две лёгкие (L-цепи), состоящие из 2 доменов (рис. 1). Два вариабельных домена (VH и VL) образуют трёхмерную структуру, ответственную за специфическое связывание с антигеном, — антигенсвязывающий центр. Тяжёлые и лёгкие цепи попарно, а также тяжёлые цепи между собой соединены дисульфидными связями. Кроме того, существуют внутридоменные дисульфидные связи. Дисульфидные связи, соединяющие между собой тяжёлые цепи, образуют шарнирную зону и не входят в состав доменов. Общее количество дисульфидных взаимодействий в молекуле IgG может колебаться от 16 до 25 в зависимости от субкласса IgG [5]. Дисульфидные связи легко подвергаются восстановлению до тиоловых групп, способных вступать в химические реакции с модифицирующими агентами, в частности на основе малеимидных групп.

 

Рис. 1. Общее строение IgG: структурная схема слева и пространственная 3D-модель справа. VL и CL — домены лёгкой цепи, VH, CH1, CH2 и CH3 — домены тяжёлой цепи, 1 — антигенсвязывающий центр, 2 — шарнирная область, образованная дисульфидными связями между тяжёлыми цепями, 3 — дисульфидная связь между доменами CH1 и CL, 4 — олигосахаридная цепь, связанная с Asp 297 домена CH2.

Fig. 1. The general structure of IgG: a block diagram on the left and a 3D model on the right. VL and CL are light chain domains, VH, CH1, CH2 and CH3 are heavy chain domains. 1 is the antigen binding center, 2 is the hinge region formed by disulfide bonds between heavy chains, 3 is the disulfide bond between the CH1 and CL domains, 4 is the oligosaccharide chain associated with the Asp 297 CH2 domain.

 

Полипептидная часть IgG составляет не менее 97% его массы и является самой перспективной для модификации по аминогруппам лизина и аргинина. С реакционной способности аминогрупп начиналась история модификации IgG, известная прежде всего по реакции связывания IgG с изотиоцианатом флуоресцеина. Однако здесь есть определённые ограничения. Прежде всего значительная часть аминокислотных остатков, которые можно использовать для синтеза, находятся внутри доменов и недоступны для химических реакций. С другой стороны, модификации в области антигенсвязывающего центра могут принципиально изменить его структуру и привести к нарушению антигенсвязывающей активности антител (рис. 2).

 

Рис. 2. Сайты расположения доступных для модификации химических групп на молекуле IgG: структурная схема слева и пространственная 3D-модель справа. Модификации в области константной части тяжёлой (1) и лёгкой (2) цепи IgG по аминогруппам, сульфгидрильные группы восстановленных дисульфидных связей (3), окисленные гексозы олигосахаридных последовательностей (4), модификации полипептидной последовательности в области антигенсвязывающего центра (в зоне вариабельных доменов IgG) (5) могут привести к нарушению антигенсвязывающей активности антител.

Fig. 2. The locations of the chemical groups available for modification on the IgG molecule: a block diagram on the left and a 3D model on the right. Modifications in the region of the constant part of the heavy (1) and light (2) IgG chains by amino groups, 3 — sulfhydryl groups of reduced disulfide bonds, 4 — oxidized hexoses of oligosaccharide sequences, 5 — modifications of the polypeptide sequence in the region of the antigen binding center (in the zone of variable IgG domains) can lead to a violation of the antigen binding activity of antibodies.

 

Оставшиеся 3% массы приходятся на олигосахаридные последовательности в области CH2-домена. Существуют разработанные подходы к использованию олигосахаридов для химических модификаций — периодатное окисление входящих в их состав сахаров, приводящее к образованию активных альдегидных групп, хорошо реагирующих с аминами, гидразинами, тиосемикарбозидами и т.д.

Проведённый анализ структуры IgG позволяет сформулировать три типа химических групп на молекуле МКАТ, пригодных для проведения модификации (см. рис. 2):

• свободные аминогруппы полипептидных цепей (прежде всего лизина и аргинина);
• дисульфидные связи между цепями и внутри доменов;
• олигосахаридные последовательности тяжёлых цепей.

ЦЕЛЬ

Целью данного исследования являлся анализ иммуноконъюгатов, полученных на основе модельной целевой молекулы — родамина В (Rod).

Выбор Rod в качестве ЦМ для получения иммуноконъюгатов в данной работе может показаться неожиданным, так как это вещество не имеет доступных для проведения синтеза с IgG реакционных групп. Тем не менее низкая молекулярная масса, высокая гидрофобность и плохая растворимость в водных растворах роднит Rod с большим количеством фармакологических веществ, используемых в лечении онкологических заболеваний, таких как цитостатики, ингибиторы микрофиламентов, агонисты STING и т.д., что оправдывает выбор Rod в качестве такой модели. С другой стороны, Rod обладает хорошей детектируемостью по специфическому поглощению квантов света при 565 нм, что позволяет легко вычислять его включённость в комплекс с IgG.

Следует отметить, что данная работа выполнялась в рамках научно-исследовательской работы «Разработка нового класса противоопухолевых препаратов, основанных на таргетной стимуляции сигнального пути STING в злокачественных новообразованиях» (№ 123021500025-1). Исследуемые в рамках этой работы препараты MSA-2 [6] и DMXAA [7] также не способны вступать в прямое взаимодействие с IgG, но, как и Rod, имеют карбоксильную группу для доработки молекулы до реакционноспособной ЦМ. Поэтому в рамках исследования способов получения иммуноконъюгатов предполагалась оценка методов модификации ЦМ, изначально не способных к взаимодействию с IgG.

В связи с этим задачами данной работы являлись:

• синтез двух производных Rod: родамин-пиперазина (Rod-пиперазин) и его комплекса с бифункциональным агентом SMCC (Rod-SMCC);
• получение на их основе иммуноконъюгатов с различными МКАТ, синтез которых проведён по тиоловым (восстановленным дисульфидным) и альдегидным (окисленным гексозам) сайтам молекулы IgG;
• исследование антигенсвязывающих и молекулярных характеристик полученных иммуноконъюгатов.

МЕТОДЫ

Дизайн исследования

Данная работа состояла из трёх этапов:

• первый этап — синтез двух производных родамина В: [6-(диэтиламино)-9-[2-(пиперазин-1-карбонил)фенил]ксантен-3-илиден]-диэтилазаниум хлорида (пиперазинамид родамина В, Rod-пиперазин) и N-(6-(диэтиламино)-9-(2-(4-(4-((2,5-диоксо-2,5-дигидро-1H-пиррол-1-ил)метил)циклогексан-1-карбонил)пиперидин-1-карбонил)фенил)-3H- ксантен-3-илиден]-диэтилазаниум хлорид (Rod-SMCC);
• второй этап — получение иммуноконъюгатов на основе синтезированных производных родамина В;
• третий этап — исследование иммунологических и молекулярных свойств полученных иммуноконъюгатов.

Условия проведения и продолжительность исследования

Исследования проводились на базе Национального медицинского исследовательского центра онкологии им. Н.Н. Блохина и Института элементоорганических соединений им. А.Н. Несмеянова. Продолжительность исследований: октябрь 2023 — ноябрь 2025 г.

Получение пиперазинамид родамина В, Rod-пиперазина

Схема реакции представлена в Приложении 1, рис. 3.

Родамин В (1,05 ммоль, 500 мг), DMAP (0,105 ммоль, 13 мг) и NHS (1,3 ммоль, 150 мг) растворяли в ацетонитриле (10 мл) при перемешивании. К реакционной смеси добавляли по каплям раствор DCC (2,7 ммоль, 556 мг) в ацетонитриле (10 мл). После 20 мин перемешивания выпадал белый осадок. Отдельно готовили раствор пиперазина (10,5 ммоль, 903 мг) в ацетонитриле (20 мл) при небольшом нагревании. Полученную суспензию с родамином В помещали в капельную воронку и в течение 2 часов добавляли по каплям к раствору пиперазина при перемешивании, перемешивали 12 часов. Образование продукта контролировали по ТСХ (пластины Merck TLC Silicagel 60 F₂₅₄ (силикагель, элюент хлороформ-метанол 2:1). Осадок фильтровали, оставшийся раствор упаривали на роторном испарителе, сушили в вакууме водоструйного насоса при 60 °С. Полученный остаток делили с помощью колоночной хроматографии (силикагель, градиентное элюирование — хлороформ-метанол от 9:1 до 1:1). Продукт дополнительно кристаллизовали из смеси метанол-диэтиловый эфир. Остаток растворяли в минимальном количестве метанола, затем при перемешивании добавляли диэтиловый эфир до выпадения осадка, выдерживали 2 часа при 8 °С. Осадок фильтровали, промывали диэтиловым эфиром, сушили на воздухе.

Получение комплекса Rod-пиперазина с бифункциональным агентом SMCC (Rod-SMCC)

Схема реакции представлена в Приложении 1, рис. 4.

Смешали 8,5 мг линкера SMCC и 14,0 мг Rod-пиперазина в 2 мл ацетонитрила, перемешивали ночь при комнатной температуре, практически всё растворилось, добавили 2 мл воды для инъекций, получили прозрачный светло-жёлтый раствор, добавили еще 3 мл воды, началось образование осадка, раствор продували воздухом для испарения ацетонитрила около 30 мин. Полученный красно-коричневый осадок в воде охладили до 5–10 °С, отфильтровали, промыли водой с температурой 0 °С и сушили.

Получение и фракционирование моноклональных антител

Источником МКАТ служили асцитные жидкости мышей линии BALB/c, полученных путём разведения в виварии ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России, в возрасте 2–3 месяцев, массой 20–22 г, находящихся на конвенциальном содержании. Для получения асцитной жидкости одного клона МКАТ было задействовано от 7 до 12 мышей. Опытным мышам за 3–4 недели до развития у них асцита внутрибрюшинно имплантировали 1 млн гибридомных клеток. Собранную асцитную жидкость замораживали при -20 °С. Асцит перед фракционированием размораживали, доводили до комнатной температуры и осветляли центрифугированием в течение 30 мин при 2000 g на центрифуге Gyrozen centrifuge 1580R (Китай).

Фракционирование МКАТ из асцитной жидкости проводили несколькими методами, чтобы оценить влияние метода фракционирования МКАТ на свойства получаемого иммуноконъюгата. Фракционировали одним из следующих методов.

• Аффинной хроматографией на бактериальном белке G [8]. Для этого 5–10 мл асцитной жидкости наносили на HiTrap с белок G-сефарозой (Amersham, США), уравновешенной PBS, со скоростью 1–2 мл/мин. Препаративные хроматографические разделения здесь и далее проводили на хроматографической установке FPLC (Pharmacia, Швеция). Колонку тщательно отмывали PBS, контролируя выход белковых продуктов денситометрией при 280 нм. Далее на HiTrap подавали 100 мМ глицин-HCL буфер с рН 3,2. Выходящую в кислой среде фракцию антител немедленно нейтрализовали 1М Трисом до рН 7,0–7,5. Полученные антитела переводили в PBS и при необходимости концентрировали (см. ниже).
• Анионообменной хроматографией на колонке MonoQ (Amersham, США) после предварительного переосаждения сульфатом аммония [9]. Для этого 5–15 мл асцитной жидкости термостатировали при +4 °С при постоянном перемешивании на магнитной мешалке и капельно добавляли равный объём насыщенного при +4 °С раствора сульфата аммония в течение 10–15 минут. Образовавшийся осадок отделяли центрифугированием 30 мин при 2000 g и ресуспендировали в PВS в объёме, равном 0,5 объёма исходного асцита. Процедуру высаливания повторяли ещё раз. Полученный осадок отделяли центрифугированием 30 мин при 2000 g и ресуспендировали в PВS. Полученный препарат переводили в Tris-HCl (см. ниже) и наносили на колонку MonoQ 10/100, уравновешенную тем же буфером. Скорость потока составляла 1 мл/мин, выход белковых продуктов оценивали денситометрией при 280 нм. После отмывки колонки от несвязавшейся белковой фракции на неё подавали градиент 0–40% 1М раствора NaCl на Tris-HCl. Выходящие фракции собирали по 1 мл, и в последующем анализировали SDS-ПААГ электрофорезом по Лэммли [10] на наличие IgG. Фракции, имеющие молекулярную чистоту 95–98%, объединяли.
• МКАТ Трастузумаб получали из фармакологического препарата Тразимера фирмы Pfizer путём удаления низкомолекулярных стабилизирующих и консервирующих добавок на колонке PD-10.
• Часть МКАТ и иммуноконъюгатов анализировали на гельфильтрующей колонке Superdex 200 10/300 (Amersham), предварительно откалиброванной с помощью маркёров молекулярных масс. На колонку наносили 0,5–0,7 мл раствора анализируемых антител в PBS и проводили разделение при скорости потока 0,5 мл/мин. Выход белковых продуктов оценивали денситометрией элюата при 280 нм.

Подготовка IgG

Для смены буфера в препаратах IgG и иммуноконъюгатах, а также для удаления низкомолекулярных промежуточных продуктов синтеза иммуноконъюгатов использовали колонки PD-10 (Amersham, США) согласно инструкции производителя.

Для концентрирования образцов IgG и иммуноконъюгатов применяли центрифужный фильтр Centriclon 30 (Millipore, США). При этом пользовались инструкцией производителя: 0,5–1,5 мл белкового раствора помещали в фильтр и центрифугировали 10–30 минут при 2000 g.

Конъюгирование IgG c Rod-SMCC

Схема реакции представлена в Приложении 1, рис. 5. Для конъюгирования брали IgG в PBS-ЭДТА в концентрации 6–8 мг/мл в объёме 0,5 мл. К IgG добавляли 50 мкл 0,5 М раствора DTT в PBS-ЭДТА и инкубировали 0,5 часа в темноте при комнатной температуре с перемешиванием. После завершения инкубации модифицированные IgG освобождали от продуктов реакции и концентрировали до объёма 0,6–1,0 мл, делили на части, соответствующие 1 мг IgG, и к каждой части добавляли различные количества Rod-SMCC, растворённого в DMSO. Реакционные смеси инкубировали в темноте при +4 °С при постоянном перемешивании в течение 20 часов. Реакцию останавливали добавлением 40 мкл 0,1 мМ раствора NEM с последующей инкубацией при комнатной температуре при постоянном перемешивании в течение 45 мин. Полученные образцы освобождали от непрореагировавших низкомолекулярных компонентов (см. выше) и определяли молярное включение родамина в иммуноконъюгат.

Конъюгирование IgG c Rod-пиперазином

Схема реакции представлена в Приложении 1, рис. 6. IgG переводили в PBS и концентрировали до 5−10 мг/мл. Готовили свежий 100 мМ раствор натрия периодата (NaIO₄ — Sigma, США). К образцам IgG добавляли NaIO₄ до конечной концентрации 20 мМ и выдерживали в темноте при температуре 25 °C с постоянным перемешиванием в течение 30 мин. К реакционной смеси добавляли 100 мкл этиленгликоля и продолжали инкубировать ещё 15 мин. По завершении реакции IgG отделяли (см. выше) от непрореагировавших продуктов и доводили концентрацию IgG до 1,5−4,0 мг/мл. Для получения маточного раствора Rod-пиперазин растворяли в DMSO в концентрации 16 мг/мл. Сразу после окисления IgG к ним добавляли разные объёмы маточного раствора Rod-пиперазин и инкубировали в темноте при 25 °С при постоянном перемешивании в течение 24 ч. Образовавшееся на этом этапе шиффово основание между окисленными гексозами олигосахарида IgG и пиперазином восстанавливали инкубацией с цианоборгидридом (NaBH₃CN) при концентрации последнего в реакционной смеси 5 мг/мл, инкубацию проводили при 4 °С в течение 1,5 ч. После завершения инкубации IgG отделяли (см. выше) от продуктов синтеза и определяли молярное включение родамина в иммуноконъюгат.

Определение спектральных характеристик Rod-пиперазина

Спектрофотометрические исследования здесь и далее проводили на спектрофотометре FlexA-200HT (Allsheng, Китай). Для определения спектральных характеристик Rod-пиперазина снимали спектр Rod-пиперазина в различных разведениях (пример спектра Rod-пиперазина при концентрации 0,00002955 моль/л представлен на рис. 7). Далее по распечатке данных спектрофотометра определяли максимум поглощения, который соответствовал 565±1 нм, рассчитывали коэффициент молярной экстинкции Rod-пиперазина. Полученное значение соответствовало 69135±234 М^-1см^-1. Кроме того, была рассчитана доля поглощения Rod-пиперазина при 280 относительно этого максимума. Полученная величина равна 0,14±0,02.

 

Рис. 7. Спектр Rod-пиперазина при концентрации 0,00002955 моль/л.

Fig. 7. The spectrum of Rod-piperazine at a concentration of 0.00002955 mol/l.

 

Определение молярного включения родамина В в иммуноконъюгаты

Полученные образцы иммуноконъюгатов анализировали, используя ранее определённый максимум поглощения Rod-пиперазина, его молярную экстинкцию и коэффициент коррекции поглощения IgG, обусловленный поглощением Rod-пиперазином. Степень включения Rod в IgG определяли спектрофотометрически, измеряя поглощение конечного продукта при двух длинах волн — 280 и 565 нм, и рассчитывали по формулам (1) и (2), используя руководство фирмы ThermoFisher Scientific:

• определение молярной концентрации IgG в составе иммуноконъюгата (М^-1см^-1):

$\text{[IgG] =}\frac{(A_{280}-(\mathrm{0,14}\times A_{565}\left)\right)}{\epsilon }$, (1)

где А₂₈₀ — оптическая плотность раствора при 280 нм, А₅₆₅ — оптическая плотность раствора при 565 нм, ε — молярная экстинция IgG при 280 нм = 210 000 М^-1см^-1;

• молярное отношение Rod-пиперазина в иммуноконъюгате (моль/моль):

$\frac{\text{Rod - пиперазин}}{\text{IgG}}=\frac{A_{565}}{\text{(}\epsilon \text{'}\times \left[\text{IgG}\right])}$, (2)

где А₅₆₅ — оптическая плотность раствора при 565 нм, ε’ — молярная экстинция Rod-пиперазина при 565 нм = 69 135 М^-1см^-1.

Этическая экспертиза

Исследование одобрено комиссией по биоэтике НИИ ЭДиТО ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России (выписка из протокола заседания № 2025-1е от 21 января 2025 года).

Статистическая обработка

Статистическая обработка данных и построение графиков выполнены в программе Microsoft Excel 2010 (версия 14.0.7268.5000). Все численные значения приведены в виде среднего из не менее трёх повторов и стандартного отклонения.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Характеристика Rod-пиперазина

В результате синтеза было получено 320 мг тёмно-красного порошка. Выход 56%. ЯМР ¹H (СDCl₃, δ, м.д., J/Гц): 1,35 (т, J = 6.62, 12H, -CH2CH3), 2.9 (с, 4H, N(CH2CH2)2NH), 3.65 (м, 12H, -CH2CH3 и N(CH2CH2)2NH), 6.77 (с, 2H, C1-H), 7.01 (д, J = 9.37, 2H, C3-H), 7.23 (д, J = 9.37, 2H, C2-H), 7.35 (м, 1H, C4-H), 7.57 (м, 1H, C7), 7.69 (м, 2H, C5-H и C6-H).

По данным высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на приборе 1260 Infinity II (Agilent Technologies, США) чистота полученного продукта составила не менее 95%. В масс-спектре присутствует молекулярный ион синтезированного продукта.

Характеристика Rod-SMCC

После очистки при помощи препаративной хроматографии было получено 12 мг (63%) соединения. При анализе в ВЭЖХ полученного конъюгата на приборе 1260 Infinity II (Agilent Technologies, США) не обнаруживали пик исходного SMCC, а чистота синтезированного вещества составила более 93%. В масс-спектре обнаружен молекулярный ион коньюгата, что подтверждает строение полученного продукта.

Характеристика иммуноконъюгатов IgG c Rod-SMCC

Для приготовления иммуноконъюгатов использовали 4 образца МКАТ:

• ICO 204 (мышиные МКАТ IgG1 класса, взаимодействующие с сывороточным простатическим антигеном), полученный анионообменной хроматографией (ICO 204 MonoQ);
• ICO 204, полученный хроматографией на белке G (ICO 204 PrG);
• ICO 180 (мышиные МКАТ IgG2 класса, взаимодействующие с рецептором CD 20), полученный хроматографией на белке G;
• Трастузумаб (рекомбинантные МКАТ IgG1 класса, взаимодействующие с рецептором HER-2).

Для всех исследованных антител реакция с Rod-SMCC приводила к включению Rod в состав иммуноконъюгата (рис. 8).

 

Рис. 8. Плотность включения Rod в зависимости от количества Rod-SMCC в реакционной смеси: a — для ICO 204 MonoQ, b — для Трастузумаба, c — для ICO 204 PrG, d — для ICO 180.

Fig. 8. The Rod/IgG molar ratios depends on the amount of Rod-SMCC in the reaction mixture for: a — ICO 204 MonoQ, b — Trastuzumab, c — ICO 204 PrG, d — ICO 180.

 

Как видно из рис. 8, реакция была дозозависимой: с увеличением количества Rod-SMCC в реакционной смеси увеличивалось количество молей Rod на моль IgG. Для всех антител было достигнуто состояние насыщенности реакции, то есть максимально возможного включения Rod в молекулу IgG. Насыщающая доза Rod-SMCC лежала в диапазоне 150–250 мкг Rod-SMCC на 1 мг IgG. При этом для разных антител предельное включение Rod было различным. Максимальным оно было для ICO 204 MonoQ и составляло около 12 молей. Для Трастузумаба и ICO 204 Pr-G насыщение составило около 5,5 моля, для ICO 180 — менее 5.

При этом полученные иммуноконъюгаты сохраняли присущую им антигенсвязывающую способность. Так, для ICO 204, имеющего сродство к простатическому сывороточному антигену (ПСА), была проведена реакция непрямого иммуноферментного анализа на планшетах, покрытых ПСА, с последующей реакцией с конъюгатом пероксидазы к IgG мыши (рис. 9).

 

Рис. 9. Кривые титрования в реакции непрямого иммуноферментного анализа ICO 204 MonoQ (a) и иммуноконъюгатов ICO 204 MonoQ с Rod-SMCC (b–d) в реакции непрямого иммуноферментного анализа на простатический сывороточный антиген. Плотность Rod (моль Rod на моль IgG) в иммуноконъюгатах: b — 8,01, c — 4,23, d — 3,1.

Fig. 9. Titration curves in the reaction of indirect ELISA ICO 204 MonoQ (a) and immunoconjugates ICO 204 MonoQ with Rod-SMCC (b–d) in the reaction of indirect ELISA with PSA. The Rod/IgG molar ratios (moles of Rod per mole of IgG) in immunoconjugates is: b — 8,01, c — 4,23, d — 3,1.

 

Как следует из рис. 9, конъюгирование ICO 204 с Rod существенно не отражалось на взаимодействии этих антител со своим антигеном, о чём свидетельствуют гомологичные кривые титрования.

Следующим важным аспектом проведённых исследований была оценка массы выхода иммуноконъюгата относительно массы вступившего в реакцию IgG. Как показано в табл. 1, увеличение плотности включения Rod в целом сопровождалось уменьшением выхода иммуноконъюгата. Если в качестве критической потери рассматривать 15%, то для ICO 204 MonoQ критичным является включение более 11 молей Rod, для Трастузумаба — более 5,5. С другой стороны, для ICO 204 PrG и ICO 180 критичными были все варианты приготовления иммуноконъюгатов, иными словами, любое введение Rod в структуру этих антител сопровождалось большими потерями продукта.

 

Таблица 1. Выход иммуноконъюгатов в процентах от внесённой массы IgG в результате мечения различными концентрациями Rod-SMCC (в скобках — плотность моль Rod на моль IgG)

Table 1. The yield of immunoconjugates as a percentage of the introduced IgG mass as a result of labeling with various concentrations of Rod-SMCC (the ratio of Rod moles per mole of IgG in parentheses)

МКАТ	Концентрация Rod-SMCC
	500	250	200	150	100	50
ICO 204 MonoQ	60*±10,2 (11,5)	–	88±8,2 (11)	89±7,7 (9,0)	85±8,0 (8,2)	86±5,1 (5,3)
Трастузумаб	–	76*±7,4 (5,5)	89±8,4 (5,45)	106±15,4 (5,1)	102±16,6 (3,2)	–
ICO 204 PrG	–	24*±4,6 (5,8)	–	39*±7,5 (5,25)	–	64*±9,5 (3,8)
ICO 180	–	–	0*±0,2	37*±5,8 (4,5)	47*±6,2 (4,3)	–

Примечание. * потери более 15%, МКАТ — моноклональные антитела.

 

Полученные иммуноконъюгаты были проанализированы с помощью гельфильтрации на колонке Superdex 200. Исходный образец ICO 204 MonoQ и Трастузумаба и полученные на их основе иммуноконъюгаты наносили на колонку и анализировали выходящие из неё белковые фракции. Хроматограммы для ICO 204 MonoQ представлены на рис. 10. Зоны, помеченные голубым цветом, соответствуют выходу мономерного IgG (около 150 кДа), зоны левее от них — агрегатам IgG, правее — его фрагментам. Фракции, соответствующие мономерному IgG, собирали и повторно определяли плотность включения Rod. Наблюдаемая плотность включения Rod в мономерных иммуноконъюгатах уменьшалась на 1–4 моля на моль IgG (табл. 2).

 

Рис. 10. Хроматограммы ICO 204 MonoQ (a) и иммуноконъюгатов ICO 204 MonoQ с Rod (b–d) на гельфильтрующей колонке Superdex 200 10/300. Плотность Rod (моль Rod на моль IgG) в иммуноконъюгатах: b — 5,34, c — 8,23, d — 10,96. Голубым цветом выделена зона выхода белка с молекулярной массой около 150 кДа. По оси ординат — оптическая плотность элюата, по оси абсцисс — объём элюирующего буфера, прошедший через колонку (мл).

Fig. 10. Chromatograms of ICO 204 MonoQ (a) and ICO 204 MonoQ immunoconjugates with Rod (b–d) on a Superdex 200 10/300 gel filtration column. The Rod/IgG molar ratios (moles of Rod per mole of IgG) in immunoconjugates is b — 5.34, c — 8.23, d — 10.96. The blue color indicates the release zone of a protein with a molecular weight of about 150 kDa. On the ordinate axis is the optical density of the eluate, on the abscissa axis is the volume of the elution buffer passed through the column (ml).

 

Таблица 2. Плотность включения моль Rod на моль IgG в иммуноконъюгаты до и после сепарации на Superdex 200

Table 2. The ratio of Rod moles per mole of IgG in immunoconjugates before and after separation on Superdex 200

МКАТ	Концентрация Rod-SMCC
	50	100	200
ICO 204 MonoQ	5,34±1,2	8,23±1,7	10,96±1,3
ICO 204 MonoQ, фракционированный на Superdex 200	2,91±0,7	4,03±1,5	7,94±1,8
Трастузумаб	3,02±0,9	5,19±1,7
Трастузумаб, фракционированный на Superdex 200	1,97±0,6	3,32±1,2

Примечание. МКАТ — моноклональные антитела.

 

Характеристика иммуноконъюгатов IgG c Rod-пиперазином

Модификации с использованием Rod-пиперазина осуществлялись на моделях ICO 204 MonoQ и Трастузумаба. Результаты представлены на рис. 11.

 

Рис. 11. Плотность включения Rod (моль Rod на моль IgG — по оси ординат) в зависимости от количества Rod-пиперазина в реакционной смеси (мкг Rod на 1 мг IgG — по оси абсцисс): a — для ICO 204 MonoQ, b — для Трастузумаба.

Fig. 11. The Rod/IgG molar ratios (moles of Rod per mole of IgG — on the ordinate axis), depending on the amount of Rod-piperazine in the reaction mixture (micrograms Rod per 1 mg of IgG — on the abscissa axis) for: a — ICO 204 MonoQ, b — Trastuzumab.

 

Как видно из рис. 11, максимальная плотность включения Rod составляла менее 3 молей для ICO 204 и менее моля для Трастузумаба. С другой стороны, не удалось получить насыщающего включения Rod, как это было достигнуто в случае синтеза на основе Rod-SMCC, что свидетельствует о возможных стерических препятствиях для протекания данной реакции, особенно выраженных в данном случае для Трастузумаба. На данную схему синтеза подана патентная заявка [11].

ОБСУЖДЕНИЕ

В данной работе был осуществлён синтез двух производных Rod: родамин-пиперазина (Rod-пиперазин) и его комплекса с бифункциональным агентом SMCC (Rod-SMCC). Это позволило получить в первом случае амидную группу в составе родамина В, а во втором — малеимидную для взаимодействия с химическими группами в составе МКАТ.

С использованием Rod-SMCC были получены иммуноконъюгаты по тиоловым группам с 4 исследованными антителами с максимальным насыщением для каждого антитела. Максимальное включение, около 10,96±1,3 моля Rod на моль IgG, было получено для ICO 204 MonoQ, около 5,19±1,7 — для Трастузумаба. Полученные иммуноконъюгаты ICO 204 MonoQ сохраняли антигенсвязывающую активность, сопоставимую с нативными антителами.

Однако следует иметь в виду, что полученные значения включения Rod в иммуноконъюгаты могли быть следствием методологических особенностей подхода: внесение слишком больших количеств гидрофобных ЦМ могло вызывать частичную денатурацию и агрегацию МКАТ, о чём свидетельствуют приведённые ранее данные (см. табл. 1). Агрегаты белковых молекул могут иметь иную молярную экстинкцию, а также приводить к рассеиванию света, что вносит погрешности в определяемые нами по этим показателям значения плотности включения ЦМ в иммуноконъюгат. Наиболее выраженная агрегация наблюдалась у антител, фракционированных с помощью кислотной элюции, для которых отмечена максимальная потеря продукта в ходе синтеза. Как известно, даже не подвергнутый воздействию IgG может содержать как агрегаты, чаще всего димеры, так и различные молекулярные фрагменты [12]. После выделения мономерной формы иммуноконъюгатов на гельфильтрующей колонке Superdex 200 (см. рис. 10) наблюдаемая плотность включения Rod в иммуноконъюгаты уменьшалась и составляла максимум 7,94±1,8 для ICO 204 MonoQ и 3,32±1,2 для Трастузумаба (см. табл. 2). Поэтому более объективными следует считать те значения включения ЦМ в состав иммуноконъюгатов, которые были получены после их дополнительного фракционирования. Тем более что если иметь в виду использование иммуноконъюгатов в качестве внутривенных препаратов, избавление от немономерных форм является необходимой стадией в ходе синтеза.

Относительно объективности полученных значений включения ЦМ в состав МКАТ. В нашем методе было использовано восстановление дисульфидных связей между (внутри) цепями IgG. Из литературных данных известно, что различные S-S связи в структуре IgG по-разному реагируют на восстанавливающие агенты. Так, для IgG1, к которым относятся ICO 204 и Трастузумаб, было выявлено снижение чувствительности дисульфидных связей к восстановлению в следующем порядке: между цепями > внутри цепей; внутри цепей LC-HC > верхняя внутри цепей HC-HC > нижний уровень HC-HC внутри цепи; между цепей CH2 > VL, CL, VH, между цепями CH1 > между цепей CH3 и между цепей LC-HC > между цепей HC-HC [13]. Таким образом, из имеющихся не менее 16 дисульфидных связей в IgG1 [5] включение до 8 ЦМ представляется возможным без разрушения структуры IgG. Нужна ли максимально возможная насыщенность иммуноконъюгата целевыми молекулами? Это зависит, прежде всего, от фармакологических свойств получаемого иммуноконъюгата. Так, среднее количество молекул цитостатика Эмтанзина в препарате Кадсила, синтезированного на основе Трастузумаба, составляет 3,5 моля на моль Трастузумаба [14], что оказалось достаточно для фармакологического действия данного препарата. С другой стороны, избыточное включение ЦМ в иммуноконъюгат чревато существенным изменением его заряда и гидрофобности, что может отразиться на фармакокинетических особенностях препарата. В данном же исследовании мы показали лишь возможный диапазон включения ЦМ в некоторые МКАТ. Что касается видимых, более чем в 2 раза, различий во включении ЦМ в МКАТ ICO 204 и Трастузумаб, то причина может быть в различиях их синтеза. Так, мышиные ICO 204 явились продуктом синтеза гибридомных клеток in vivo в брюшной полости мышей, тогда как рекомбинантное МКАТ Трастузумаб получено путём культивирования продуцентов in vitro в культуральной среде. В ряде случаев показана возможность появления нетипичных изоформ дисульфидных связей в структуре IgG при наработке рекомбинантных МКАТ в культиваторах [15, 16]. Вероятно, это может быть причиной различной чувствительности описанных выше МКАТ к восстановлению дисульфидных связей и, как следствие, к включению ЦМ в иммуноконъюгат. Но это предположение требует тщательных проверок.

Нами отмечено заметное отличие в характеристиках иммуноконъюгатов на основе одного клона МКАТ, но фракционированных различными методами. Так, различия между ICO 204 MonoQ и ICO 204 PrG заключаются в способе их фракционирования из асцитной жидкости, где для первых антител все процедуры проводились в относительно физиологических условиях, при том что ICO 204 PrG и ICO 180 объединяет наличие кислотного воздействия во время фракционирования. На основании этого можно предположить, что кислотная элюция на протеине A или G во время фракционирования МКАТ негативно сказывается на структуре антител [17] и ухудшает их последующие химические модификации. Следует также обратить внимание на то, что если для ICO 204 MonoQ предельное включение Rod составляло 10,96±1,3 моля, то для ICO 204 PrG — 5,8±0,7 (см. Приложение 1, рис. 4), что косвенно подтверждает изменение в структуре IgG при таком воздействии.

Использование Rod-пиперазина позволило получить иммуноконъюгаты с МКАТ ICO 204 и Трастузумабом по окисленным углеводным остаткам антител. Максимальная плотность включения Rod в эти соединения для ICO 204 MonoQ составляла 2,3±0,3 моля на моль IgG. Близкие значения получены нами ранее для мышиных МКАТ и другой ЦМ — флуоресцеин-5-тиосемикарбозида [18]. В отличие от структуры белковой части МКАТ, углеводные остатки антител очень вариативны даже в пределах продуктов синтеза одного клона. Такая вариативность показана у продуцентов Трастузумаба [19]. От структурного профиля углеводных остатков в значительной степени зависят физиологические свойства антител, такие как антителозависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность, связывание с C1q комплемента, связывание с Fc-рецептором, термостабильность, склонность к агрегации, клиренс и т.д. [20, 21]. Профиль гликозилирования Трастузумаба подвергается тщательному контролю при производстве [22]. Как следует из указанного патента, определяемые углеводы в составе Трастузумаба содержат менее 5% сиалированных (терминальных) вариантов углеводных остатков, а следовательно, представляют относительно короткие варианты углеводных цепочек. Для описанных в литературе примеров культивируемых рекомбинантных клонов процент сиалированных МКАТ может достигать 50 [23]. Короткие углеводородные остатки, расположенные в складке между VH2-доменами IgG, скорее всего, плохо доступны для взаимодействия с ЦМ. Возможно, именно этим объясняется невысокое (0,2±0,12) включение Rod-пиперазина в Трастузумаб. Однако это должно быть предметом дальнейших исследований при создании иммуноконъюгатов через углеводные остатки IgG — варианте синтеза, не затрагивающего активный центр антител, а следовательно, и антигенсвязывающие свойства МКАТ.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На сегодняшний день отсутствуют готовые решения для создания иммуноконъюгатов с ЦМ, имеющей в своей структуре карбоксильные группы. В данном исследовании показана возможность синтеза реакционноспособных производных ЦМ на основе карбоксильных групп. Полученные на основе таких производных ЦМ иммуноконъюгаты обладали высокой степенью включения ЦМ, сохраняли антигенсвязывающие свойства. Показано значение способа фракционирования МКАТ для синтеза иммуноконъюгатов. Так, если МКАТ подвергались воздействию низкого pH на стадии выделения, они хуже вступали в реакцию с ЦМ и больше подвергались денатурации. Кроме того, в работе продемонстрирована необходимость дополнительного фракционирования иммуноконъюгатов после проведения их синтеза.

ДОПОЛНИТЕЛЬНАЯ ИНФОРМАЦИЯ

Приложение 1. Схемы синтеза исследуемых соединений.

doi: 10.17816/onco691726-4386995

Вклад авторов. Гриневич А.С. — анализ данных, написание черновика рукописи; Садовская Я.О. — анализ данных; Каримова А.О. — анализ данных; Рыжиков М.А. — анализ данных, валидация; Хотулева М.Г. — анализ данных; Солопова О.Н. — определение концепции, анализ данных, пересмотр и редактирование текста статьи; Гусева Е.В. — проведение исследования, анализ данных; Сиган А.Л. — проведение исследования; Гусев Д.В. — определение концепции, анализ данных, пересмотр и редактирование текста статьи. Все авторы одобрили рукопись (версию для публикации), а также согласились нести ответственность за все аспекты настоящей работы, гарантируя надлежащее рассмотрение и решение вопросов, связанных с точностью и добросовестностью любой её части.

Этическая экспертиза. Исследование одобрено комиссией по биоэтике НИИ ЭДиТО ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России (выписка из протокола заседания № 2025-1е от 21 января 2025 года).

Источники финансирования. Работа была выполнена при финансовой поддержке Минздрава России в рамках исследования № 123021500025-1 «Разработка нового класса противоопухолевых препаратов, основанных на таргетной стимуляции сигнального пути STING в злокачественных новообразованиях».

Раскрытие интересов. Авторы заявляют об отсутствии отношений, деятельности и интересов за последние три года, связанных с третьими лицами (коммерческими и некоммерческими), интересы которых могут быть затронуты содержанием статьи.

Оригинальность. При проведении исследования и создании настоящей работы авторы не использовали ранее опубликованные сведения (текст, иллюстрации, данные).

Доступ к данным. Редакционная политика в отношении совместного использования данных к настоящей работе не применима.

Генеративный искусственный интеллект. При создании настоящей статьи технологии генеративного искусственного интеллекта не использовались.

Рассмотрение и рецензирование. Рукопись направлена в редакцию в инициативном порядке и рассмотрена по обычной процедуре. В рецензировании участвовали два внешних рецензента, член редакционной коллегии и научный редактор издания.

ADDITIONAL INFORMATION

Supplement 1. Synthesis schemes of the compounds.

doi: 10.17816/onco691726-4386995

Author contributions: A.S. Grinevich: formal analysis, writing—original draft; Ya.O. Sadovskaya: formal analysis; A.O. Karimova: formal analysis; M.A. Ryzhikov: formal analysis, validation; M.G. Khotuleva: formal analysis; O.N. Solopova: conceptualization, formal analysis, writing—review & editing; E.V. Guseva: investigation, formal analysis; A.L. Sigan: investigation; D.V. Gusev: conceptualization, formal analysis, writing—review & editing. All the authors approved the version of the manuscript to be published and agreed to be accountable for all aspects of the work, ensuring that questions related to the accuracy or integrity of any part of the work are appropriately investigated and resolved.

Ethics approval: The study was approved by the Bioethics Committee of the Research Institute for Experimental Diagnostics and Therapy of Tumors, Blokhin National Medical Research Center of Oncology (extract from Minutes No. 2025-1e of January 21, 2025).

Funding sources: The work was supported by the Ministry of Health of the Russian Federation as part of study No. 123021500025-1 “Developing a New Class of Antineoplastic Agents Based on Targeted Stimulation of the Sting Pathway in Cancer.”

Disclosure of interests: The authors have no relationships, activities or interests for the last three years related with for-profit or not-for-profit third parties whose interests may be affected by the content of the article.

Statement of originality: In creating this work, the authors did not use previously published information (text, illustrations, data).

Data availability statement: The editorial policy regarding data sharing does not apply to this work, and no new data was collected or created.

Generative AI: Generative AI technologies were not used for this article creation.

Provenance and peer-review: This paper was submitted to the journal on an unsolicited basis and reviewed according to the usual procedure. Two external reviewers, a member of the editorial board, and the scientific editor of the publication participated in the review.

 

¹ Интернет-портал Российского общества клинической онкологии. Режим доступа: https://rosoncoweb.ru/news/oncology/2021/05/18/

² Calculate dye: protein (F/P) molar ratios [Internet]. Available from: https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/LSG/brochures/TR0031-Calc-FP-ratios.pdf

About the authors

Anatoliy S. Grinevich

Blokhin National Medical Research Center of Oncology

Author for correspondence.
Email: a.grinevich@ronc.ru
ORCID iD: 0000-0002-4570-2124
SPIN-code: 2535-9741
Russian Federation, Moscow

Yana O. Sadovskaya

Blokhin National Medical Research Center of Oncology

Email: ja.sadovskaja@ronc.ru
ORCID iD: 0009-0009-7115-7797
SPIN-code: 8572-7717
Russian Federation, Moscow

Anastasia O. Karimova

Blokhin National Medical Research Center of Oncology; National Research University Higher School of Economics

Email: a.karimova@ronc.ru
ORCID iD: 0009-0000-0317-9948
SPIN-code: 8054-2753
Russian Federation, Moscow; Moscow

Mikhail A. Ryzhikov

Blokhin National Medical Research Center of Oncology; National Research University Higher School of Economics

Email: m.ryzhikov@ronc.ru
ORCID iD: 0009-0000-2292-8537
Russian Federation, Moscow; Moscow

Margarita G. Khotuleva

Blokhin National Medical Research Center of Oncology

Email: m.khotuleva@ronc.ru
ORCID iD: 0009-0008-6104-5233
Russian Federation, Moscow

Olga N. Solopova

Blokhin National Medical Research Center of Oncology; National Research University Higher School of Economics

Email: o.solopova@ronc.ru
ORCID iD: 0000-0002-5465-6094
SPIN-code: 2807-7709

Cand. Sci. (Biology)

Russian Federation, Moscow; Moscow

Elizaveta V. Guseva

Nesmeyanov Institute of Organoelement Compounds

Email: lizon.00@mail.ru
ORCID iD: 0000-0003-3852-6676
SPIN-code: 5020-4002

Cand. Sci. (Chemistry)

Russian Federation, Moscow

Andrey L. Sigan

Nesmeyanov Institute of Organoelement Compounds

Email: asigan@yandex.ru
ORCID iD: 0000-0003-3627-1673

Cand. Sci. (Chemistry)

Russian Federation, Moscow

Dmitriy V. Gusev

Blokhin National Medical Research Center of Oncology

Email: d.gusev@ronc.ru
ORCID iD: 0000-0003-0218-8265
SPIN-code: 4613-3230
Russian Federation, Moscow

References

Supplementary files